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《豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(spot14)的克隆與原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬甲狀腺激素應(yīng)答基因（SPOT14）的克隆與原核表達(dá)姓名：王叢梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：楊國(guó)宇201206豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(即p刀4)的克隆與原核表達(dá)摘要甲狀腺激素應(yīng)答基因(Thyroidhormoneresponsivegene，SPOTl4)是受甲狀腺激素誘導(dǎo)表達(dá)的核內(nèi)基岡，在動(dòng)物肝臟、脂肪組織中高表達(dá)，該基岡參與脂肪合成代謝途徑限速酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)動(dòng)物脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究豬SPOTl4基岡所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)基于電子延伸序列，設(shè)計(jì)其克隆引物，利HjRT—PCR方法成功克隆了豬SPOTl4基岡，并
2、檢測(cè)了該基岡往符組織的分布情況。進(jìn)而構(gòu)建了豬SPOTl4基岡的原核表達(dá)載體pET．28a(+)．S14，并誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白，經(jīng)SDS．PAGE電泳分析和Westernblot檢測(cè)確定該融合蛋白為S14，其蛋白分子量為20．91kD。結(jié)果表明：1．豬SPOTl4基岡的克隆、序列分析與組織分布?？寺〉呢iSPOTl4基岡包含一個(gè)完整的開放閱讀框架(openreadingflame，ORF)，K度為453bp，編碼由150個(gè)氨基酸組成的S14蛋白(GenBank：JF951726)，其中酸性氨基酸35個(gè)，堿性氨基酸23個(gè)，蛋白質(zhì)分子量為：17．08kD，等電點(diǎn)為：6．15。其氨基酸序列
3、與人、牛、小鼠、褐鼠、兔、雞的同源性分另0為76．9％、80．8％、76．2％、76．2％、82．】％、32．O％，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示豬與牛的親緣關(guān)系最近。該基岡在肝臟和脂肪組織中高表達(dá)，在腦、脾臟、肖、皮膚、盲腸、直腸中表達(dá)鼙相對(duì)較低，在肺臟、十二指腸、空腸、同腸中微域表達(dá)，在腎臟、肌肉中無表達(dá)。2．豬pET．28cc(+)．S14原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定為了獲取S14的蛋白質(zhì)分子，本試驗(yàn)根據(jù)克隆序列合成一對(duì)表達(dá)引物，將豬即p丁14基岡的ORF片段兜隆劍原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，經(jīng)鹵液PCR鑒定、艤酶切鑒定、測(cè)序鑒定，確定豬SPOTl4基
4、滅l捅入的位置、人小和讀碼
5、框均正確，證實(shí)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體，將其命名為pET一28旺(+)一S14。3．豬SPOTl4基岡在人腸桿兇中的表達(dá)將獲得的重組質(zhì)粒pET一280t(+)一S14轉(zhuǎn)化入人腸桿菌(Escherichiaco療)BL2l(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，分別川小I—J終濃度的IPTG和不同的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，以確定蛋白表達(dá)的最佳條什。紅最佳誘導(dǎo)條件卜經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS—PAGE電泳檢測(cè)，表達(dá)的融合蛋白分子草約為21kD，且主要以包涵體形式存在。4．豬pET．28ct(+)．S14重綢蛋白的純化與鑒定。將獲得的包涵體，L}J6xHisNi—NTA純化梓純化斤，通過SDS．PAGE分析
6、，山現(xiàn)單一目的條帶，表明已純化得劍融合蛋白。以鼠抗6xHis標(biāo)簽單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠lgG二抗對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果在目的條帶所處位置(20．91kD)出現(xiàn)一條印跡，且分子量人小與目的蛋白的相同，證實(shí)該蛋白為所需要的目的蛋白S14。關(guān)鍵詞：豬；SPOTl4；克隆；組織分布；原核表達(dá)；純化；免疫印跡豬甲狀腺激素應(yīng)答基[](SPOTl4)的克隆與原核表達(dá)CloningandProkaryoticExpressionofThyroidHormoneResponsiveGene(SPOTl4)ofPorcineSupervisor：Prof．YangGuoyuMast
7、erCandidate：WangCongmeiAbstract：ThyroidhormoneresponsiveSPOTl4gene，whichisanucleargeneinducedbythyroidhormone，expressedpredominatelyinadiposetissueandliver．Itisinvolvedintranscriptionalregulationofrate—limitingenzymesinlipogenicpathwayItplaysanimportantroleontheregulationofanimallipogenesis．I
8、nordertofurtherstudythefunctionoftheporcineSPOTl4，theprimerwasdesignedbasedontheinsilicosequencesinformation．TheporcineSPOTl4genewasclonedbyRT-PCR，anditstissuedistributionwasdetected．TherecombinantvectorpET一28a(+)一S14wasconstructedandfusionwa
