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《豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(spot14)的克隆與原核表達(dá)》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(SPOT14)的克隆與原核表達(dá)姓名:王叢梅申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師:楊國宇201206豬甲狀腺激素應(yīng)答基因(即p刀4)的克隆與原核表達(dá)摘要甲狀腺激素應(yīng)答基因(Thyroidhormoneresponsivegene,SPOTl4)是受甲狀腺激素誘導(dǎo)表達(dá)的核內(nèi)基岡,在動物肝臟、脂肪組織中高表達(dá),該基岡參與脂肪合成代謝途徑限速酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對動物脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究豬SPOTl4基岡所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,本試驗(yàn)基于電子延伸序列,設(shè)計(jì)其克隆引物,利HjRT—PCR方法成功克隆了豬SPOTl4基岡,并
2、檢測了該基岡往符組織的分布情況。進(jìn)而構(gòu)建了豬SPOTl4基岡的原核表達(dá)載體pET.28a(+).S14,并誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白,經(jīng)SDS.PAGE電泳分析和Westernblot檢測確定該融合蛋白為S14,其蛋白分子量為20.91kD。結(jié)果表明:1.豬SPOTl4基岡的克隆、序列分析與組織分布??寺〉呢iSPOTl4基岡包含一個完整的開放閱讀框架(openreadingflame,ORF),K度為453bp,編碼由150個氨基酸組成的S14蛋白(GenBank:JF951726),其中酸性氨基酸35個,堿性氨基酸23個,蛋白質(zhì)分子量為:17.08kD,等電點(diǎn)為:6.15。其氨基酸序列
3、與人、牛、小鼠、褐鼠、兔、雞的同源性分另0為76.9%、80.8%、76.2%、76.2%、82.】%、32.O%,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示豬與牛的親緣關(guān)系最近。該基岡在肝臟和脂肪組織中高表達(dá),在腦、脾臟、肖、皮膚、盲腸、直腸中表達(dá)鼙相對較低,在肺臟、十二指腸、空腸、同腸中微域表達(dá),在腎臟、肌肉中無表達(dá)。2.豬pET.28cc(+).S14原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定為了獲取S14的蛋白質(zhì)分子,本試驗(yàn)根據(jù)克隆序列合成一對表達(dá)引物,將豬即p丁14基岡的ORF片段兜隆劍原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,經(jīng)鹵液PCR鑒定、艤酶切鑒定、測序鑒定,確定豬SPOTl4基
4、滅l捅入的位置、人小和讀碼
5、框均正確,證實(shí)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體,將其命名為pET一28旺(+)一S14。3.豬SPOTl4基岡在人腸桿兇中的表達(dá)將獲得的重組質(zhì)粒pET一280t(+)一S14轉(zhuǎn)化入人腸桿菌(Escherichiaco療)BL2l(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,分別川小I—J終濃度的IPTG和不同的誘導(dǎo)表達(dá)時間進(jìn)行誘導(dǎo),以確定蛋白表達(dá)的最佳條什。紅最佳誘導(dǎo)條件卜經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS—PAGE電泳檢測,表達(dá)的融合蛋白分子草約為21kD,且主要以包涵體形式存在。4.豬pET.28ct(+).S14重綢蛋白的純化與鑒定。將獲得的包涵體,L}J6xHisNi—NTA純化梓純化斤,通過SDS.PAGE分析
6、,山現(xiàn)單一目的條帶,表明已純化得劍融合蛋白。以鼠抗6xHis標(biāo)簽單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠lgG二抗對純化產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡檢測,結(jié)果在目的條帶所處位置(20.91kD)出現(xiàn)一條印跡,且分子量人小與目的蛋白的相同,證實(shí)該蛋白為所需要的目的蛋白S14。關(guān)鍵詞:豬;SPOTl4;克?。唤M織分布;原核表達(dá);純化;免疫印跡豬甲狀腺激素應(yīng)答基[](SPOTl4)的克隆與原核表達(dá)CloningandProkaryoticExpressionofThyroidHormoneResponsiveGene(SPOTl4)ofPorcineSupervisor:Prof.YangGuoyuMast
7、erCandidate:WangCongmeiAbstract:ThyroidhormoneresponsiveSPOTl4gene,whichisanucleargeneinducedbythyroidhormone,expressedpredominatelyinadiposetissueandliver.Itisinvolvedintranscriptionalregulationofrate—limitingenzymesinlipogenicpathwayItplaysanimportantroleontheregulationofanimallipogenesis.I
8、nordertofurtherstudythefunctionoftheporcineSPOTl4,theprimerwasdesignedbasedontheinsilicosequencesinformation.TheporcineSPOTl4genewasclonedbyRT-PCR,anditstissuedistributionwasdetected.TherecombinantvectorpET一28a(+)一S14wasconstructedandfusionwa