hhgf促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化實驗的研究論文

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1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文hHGF促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的實驗研究摘要我國有9300萬的乙型肝炎病毒攜帶者，其中2千萬人為乙肝患者，酒精性肝病及非酒精性肝病的發(fā)病率亦逐年升高，眾多慢性肝臟損傷因素導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常增生，引起肝功能失代償、肝腹水、肝癌、上消化道出血等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，藥物難以醫(yī)治，肝移植是目前治療終末期肝病最為有效的方法，但困于肝源缺乏等問題，極大的限制了其臨床應(yīng)用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其無限增殖及多向分化的潛能，有望成為治療終末期肝病的又一可行方法，并已成為研究熱點。源于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極強的可塑造性，多項研究

2、表明，其可分化為三個胚層的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞等。在急慢性肝病中，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行臨床治療已經(jīng)在多篇文獻中報道，且有多項實驗已在動物體內(nèi)或體外誘導(dǎo)過程中加入各種生長因子，以達到提高干細(xì)胞移植療效的目的，目前尚缺乏轉(zhuǎn)染基因后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞的實驗研究。有研究表明肝細(xì)胞生長因子（HGF）為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化最重要的[8]始動因子之一，HGF作用的發(fā)揮同細(xì)胞膜受體c-met的結(jié)合密不可分。HGF蛋白與其受體c-Met結(jié)合后導(dǎo)致c-Metβ鏈的酪氨酸Tyr-1234及Tyr-1235殘基

3、自身磷酸化，由此激活了受體內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞分裂或分化增加、運動能力增[19]強、細(xì)胞間連接消失，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。目的：本研究應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法，培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HGF基因轉(zhuǎn)染入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過G418篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞群后擴增出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞克隆，分別應(yīng)用激光共聚焦、RT-PCR、WesternBlot對比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中HGF的表達，此后，運用酒精性肝硬化病人血清對轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，7D及14D后分別檢測轉(zhuǎn)染前后的各個細(xì)胞組中AFP、ALB表達水平，探討轉(zhuǎn)染人促肝細(xì)胞生長因子（hHGF）對人

4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）向肝樣細(xì)胞分化的影響。方法：(+)1．克隆hHGF基因，構(gòu)建攜帶hHGF基因的真核表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-hHGF），5第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文(+)首先應(yīng)用PCR法獲得HGFcDNA，再次應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將HGFcDNA及pcDNA3.1切成粘性末端，T4連接酶連接，構(gòu)建重組載體。2．貼壁培養(yǎng)法擴增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，每日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，隔日換液，獲得了一些貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的體會與經(jīng)驗，擴增后選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行基因轉(zhuǎn)染。(+)3．用脂質(zhì)體將pcDNA3.1-hHGF轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，G418篩

5、選轉(zhuǎn)染后的陽性克隆，分別通過激光共聚焦、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫蛋白印跡(Westernblot）檢測hBMSCs中表達hHGF的水平；4．用酒精性肝硬化患者血清誘導(dǎo)hBMSCs，采用Westernblot分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）的表達變化。結(jié)果：1．瓊脂糖電泳提示，擴增的目的基因hHGF的cDNA為2200bp，成功將此cDNA與帶有粘性末端的質(zhì)粒定向連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定，hHGF基因讀碼框架完全正確；2．細(xì)胞培養(yǎng)傳代成功，細(xì)胞生長良好，呈梭形及魚群樣生長，獲取較多生長狀態(tài)良好的人骨髓

6、間充質(zhì)干細(xì)胞；3．通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒成功的導(dǎo)入了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選，激光共聚焦、RT-PCR、Westernblot結(jié)果均證實經(jīng)轉(zhuǎn)染hHGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中hHGF分子呈高表達；4．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后逐漸變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞樣細(xì)胞，形態(tài)呈三角形或不規(guī)則形，未經(jīng)誘導(dǎo)組細(xì)胞變化不明顯，Westernblot結(jié)果表明誘導(dǎo)7D，14D轉(zhuǎn)染hHGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中AFP、ALB表達明顯高于其他實驗組。結(jié)論：(+)1．?dāng)U增了hHGFcDNA全長序列，且成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hHGF；2．貼壁培養(yǎng)法可培養(yǎng)出人

7、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在體外進行大量擴增，細(xì)胞狀態(tài)良好；(+)3．重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hHGF可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，hHGF基因在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)可以成功表達目的蛋白；4．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)酒精性肝硬化血清誘導(dǎo)后可向肝樣細(xì)胞分化，hHGF基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的能力增高，表明hHGF基因在細(xì)胞內(nèi)成功表達后可以提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的能力。6第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文(+)綜上，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hHGF后可顯著提高細(xì)胞中HGF因子的表達，經(jīng)誘導(dǎo)后可提高AFP、ALB的表達水平促進向肝樣細(xì)胞分化，為終末期肝病的治療

8、提供了新思路及實驗依據(jù)。關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；人促肝細(xì)胞生長因子；肝樣細(xì)胞；甲胎蛋白；白