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1、PHEV感染對(duì)樹突狀細(xì)胞的活化及其細(xì)胞疫苗免疫保護(hù)作用Studyonimmuneeffectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirus作者姓名：趙家寬專業(yè)名稱：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：賀文琦教授學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士答辯日期：2015年6月6日中文摘要PHEV感染對(duì)樹突狀細(xì)胞的活化及其細(xì)胞疫苗免疫保護(hù)作用豬血凝性腦脊髓炎病毒（Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus
2、，PHEV）屬于β冠狀病毒屬成員，其主要侵害3周齡以內(nèi)的仔豬，臨床上常常表現(xiàn)為兩種類型，即嘔吐、衰竭或/和明顯的神經(jīng)癥狀，死亡率20%～100%。臨床上，PHEV多呈隱性感染，在豬群中不易察覺。盡管成年豬能夠較好的抵抗PHEV，但感染后會(huì)出現(xiàn)消瘦和發(fā)育不良等癥狀，且易于繼發(fā)其他病原的混合感染。目前，PHEV已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，本課題組調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)吉林、遼寧、山東等省份的豬群中PHEV感染率均為50%左右。研究表明，PHEV感染小鼠后通過神經(jīng)傳播，由于其發(fā)病急，機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答并未完全啟動(dòng)，感染
3、小鼠即已死亡，死亡率幾乎為100%。但在該病毒感染初期是否能被機(jī)體的免疫細(xì)胞所識(shí)別，目前還不清楚。樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DC）是目前已知的處理呈遞抗原能力最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（Antigenpresentingcells，APCs）。對(duì)其他多種病毒感染的研究資料證實(shí)，DC能夠識(shí)別并呈遞病毒蛋白，分泌Ⅰ型干擾素及炎性細(xì)胞因子，以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)清除并殺傷病毒感染細(xì)胞。但PHEV能否刺激DC活化，并且活化的DC對(duì)機(jī)體有無保護(hù)力未曾研究。為了解PHEV刺激對(duì)DC活化的影響，以及DC在PHEV感染
4、過程中參與免疫應(yīng)答的能力，本研究首先分離了Balbc小鼠骨髓細(xì)胞，并通過條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)8天，獲得純度約77.69%的DC。將PHEV接種DC后，觀察到細(xì)胞體積變大、產(chǎn)生大量突起、貼壁能力強(qiáng)，說明細(xì)胞成熟、吞噬及黏附能力增強(qiáng)。PHEV刺激DC后可分泌大量的炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-12等，其中IL-1β在24h分泌量達(dá)到對(duì)照組的12倍；TNF-α持續(xù)高水平分泌，約為800～1000pg/mL，為對(duì)照組的16倍，差異極顯著；表明DC的免疫調(diào)節(jié)能力處于較高水平。FACS檢測(cè)到DC
5、的CD40、CD86、MHCⅡ等表達(dá)也均上調(diào)25%左右，說明DC呈遞抗原、刺激活化T細(xì)胞的能力增強(qiáng)。qPCR和WesternBlotting結(jié)果證明NFκB和炎性復(fù)合體通路活化；但I(xiàn)FN-α、β的表達(dá)被抑制，24h和48h的表達(dá)量不到對(duì)照組的10%，TLR7的表達(dá)也同樣被抑制。上述研究結(jié)果說明PHEV在體外能有效的活化DC并促使其成熟為有效的抗原提呈細(xì)胞，具有潛在的激活淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力，為機(jī)體提供有效免疫保護(hù)。但被激活的DC并不能通過Ⅰ型干擾素途徑達(dá)到抗病毒反應(yīng)。為了確定活化、成熟的DC對(duì)小鼠是否具有免疫
6、保護(hù)作用，以負(fù)載PHEV的DC作為細(xì)胞疫苗免疫小鼠，檢測(cè)到免疫小鼠血清中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ上調(diào)1倍以上；血清PHEV抗體均呈陽性，說明小鼠體液免疫系統(tǒng)被激活。FACS分析免疫小鼠的脾臟細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，無論是負(fù)載滅活病毒還是活病毒的DC疫苗經(jīng)過兩次免疫后，CD4/CD8均比第一次免疫后高接近1倍，IFN-γ分泌T細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的1.5倍，說明小鼠的細(xì)胞免疫系統(tǒng)也同時(shí)被活化。I兩次加強(qiáng)免疫后，滴鼻接種致死劑量的PHEV，14天內(nèi)負(fù)載PHEV的DC組死亡率為25%，而負(fù)載滅活PHEV的DC組死
7、亡率僅為20%，對(duì)照組則幾乎為100%，說明負(fù)載病毒的DC能夠?yàn)樾∈筇峁┮欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)力抵抗PHEV感染。由此可見，PHEV能夠激活DC，促使其成熟、活化，表面蛋白表達(dá)，細(xì)胞因子分泌及NFκB和炎性復(fù)合體通路信號(hào)激活；負(fù)載病毒的DC疫苗能夠在一定程度上對(duì)小鼠提供免疫保護(hù)力。這些研究成果不僅為DC參與PHEV感染過程中的免疫應(yīng)答機(jī)制奠定基礎(chǔ)，而且也為開發(fā)DC細(xì)胞疫苗抵抗PHEV感染提供了重要的參考依據(jù)。關(guān)鍵詞：豬血凝性腦脊髓炎病毒；樹突狀細(xì)胞；激活；疫苗；免疫保護(hù)IIAbstractStudyonimmune
8、effectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirusPorcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus(PHEV)belongingtobetacoronavirusisasingle-strandRNAviruses.PHEVcaninfectabout1~3week-
