cdna文庫與est序列分析

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1、cDNA文庫構(gòu)建及EST序列分析陳威、丁立建、黃顯軍、劉振英、毛海花、上官巧靈、朱竹君（按姓氏首字母排列，排名不分先后）組員任務(wù)分配陳威：統(tǒng)籌安排、資料收集丁立建：cDNA文庫應(yīng)用、資料收集黃顯軍：背景簡介劉振英：cDNA文庫構(gòu)建原理、資料收集毛?；?、上官巧靈、朱竹君：EST序列分析目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構(gòu)建原理三、cDNA文庫的應(yīng)用四、EST序列分析五、參考文獻(xiàn)cDNA文庫構(gòu)建及EST序列分析背景簡介——黃顯軍cDNA基因文庫：某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDN

2、A片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。1.cDNA文庫背景簡介1.1cDNA文庫產(chǎn)生前的技術(shù)概況隨著生物及信息技術(shù)的迅速發(fā)展，尋找新基因、克隆新基因、進(jìn)而研究基因的功能已成為功能基因組研究中的一項(xiàng)重要工作。在過去尋找新基因的方法有：a）消減雜交b）mRNA差異顯示c）cDNA的代表性差異顯示分析法d）差異消減展示等方法這些方法在新基因的發(fā)現(xiàn)方面都各有其獨(dú)特的優(yōu)勢，可尋找出一些差異表達(dá)序列，但這些差異表達(dá)序列大部分情況都是不完整的基因。1.2cDNA文庫的產(chǎn)生由于以前技術(shù)的缺點(diǎn)，目前，比較可行而

3、且應(yīng)用較多的方法主要是cDNA文庫的篩選。一方面cDNA文庫只代表一定時(shí)期一定條件下正在表達(dá)的基因，是整個(gè)真核基因組中的少部分序列，因此cDNA克隆的復(fù)雜程度比直接從基因組克隆的要小得多。另一方面由于每個(gè)cDNA克隆只代表一種mRNA序列，因此在基因克隆過程中出現(xiàn)假陽性的概率比較低。所以cDNA文庫的構(gòu)建已成為當(dāng)前分子生物學(xué)研究和基因工程操作的基礎(chǔ)。1.3.為什么要構(gòu)建cDNA文庫？cDNA便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，因此可以從cDNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接

4、用于該目的基因的表達(dá)。1.4.怎么構(gòu)建cDNA文庫？1.5.cDNA文庫構(gòu)建后能干什么？1)可保護(hù)瀕危珍惜生物資源2)可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針3)可以用于分離全長基因進(jìn)而開展基因功能研究1.6.cDNA文庫的優(yōu)勢及價(jià)值1）優(yōu)勢：cDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢。2）價(jià)值：在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。2.EST序列分析背景簡介克隆

5、全長cDNA序列的傳統(tǒng)途徑：a)噬斑原位雜交的方法b)采用PCR的方法缺點(diǎn)：工作量大、耗時(shí)、耗材這些傳統(tǒng)方法已滿足不了人類基因組時(shí)代迅猛發(fā)展的要求。2.1.EST序列分析的產(chǎn)生隨著人類基因組計(jì)劃的開展，在基因結(jié)構(gòu)、定位、表達(dá)和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時(shí)避免重復(fù)工作，節(jié)省開支，已成為一個(gè)急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前。采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達(dá)分析提

6、供空前的動(dòng)力，并為生物信息學(xué)功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。2.2.EST技術(shù)的作用價(jià)值EST技術(shù)最常見的用途是基因識別，傳統(tǒng)的全基因組測序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費(fèi)時(shí)。因?yàn)榛蚪M中只有2%的序列編碼蛋白質(zhì)，因此一部分科學(xué)家支持首先對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模測序，即從真正編碼蛋白質(zhì)的mRNA出發(fā)，構(gòu)建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序。Adams等提出的表達(dá)序列標(biāo)簽的概念標(biāo)志著大規(guī)模cDNA測序時(shí)代的到來。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對不精確，精確度最高為97%，但實(shí)

7、踐證明EST技術(shù)可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。目錄一、背景簡介二、cDNA文庫構(gòu)建原理三、cDNA文庫的應(yīng)用四、EST序列分析五、參考文獻(xiàn)cDNA文庫的構(gòu)建——?jiǎng)⒄裼槭裁礃?gòu)建cDNA文庫真核生物基因結(jié)構(gòu)原核生物有很大差異。真核生物的基因不能直接在原核生物中表達(dá),只有將加工成熟的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA（cDNA），并連接相應(yīng)的原核細(xì)胞表達(dá)控制元件，才能在原核生物中表達(dá)。mRNA的不穩(wěn)定性真核細(xì)胞的基因通常只有一小部分進(jìn)行表達(dá)，由于mRNA的不穩(wěn)定性，因而對真核基因的表達(dá)和相關(guān)的mRNA

8、研究，一般都是通過對cDNA的研究來進(jìn)行。But如何構(gòu)建cDNA文庫www.themegallery.comLOGOmRNA的分離制備寡聚胸苷酸〔oligo(dT)〕纖維素或瓊脂糖親和層析法，在高鹽緩沖溶液中poly(A)＋RNA與oligo(dT)結(jié)合，低鹽緩沖溶液使它們解離。www.themegallery.comLOGOcDNA第一鏈的合成Oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成高濃度的Oligo（dT）引物與mRNA的3'末端的poly（A）配對。優(yōu)點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)基本被限定在以mRNA為模板