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《除蟲菊花均一化cdna文庫的構(gòu)建與est序列分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、ConstructionandESTsAnalysisofTheNormalizedcDNALibraryfromChrysanthemumCinerariifoliumFlowersAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomybyBianWanpingSupervisor:Prof.LiZhengguoMajor:GropGeneticsandBreedingCollegeofBioengineeringofC
2、hongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2008重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要摘要除蟲菊（ChrysanthemumCinerariifolium）是菊科多年生草本植物，是目前世界上唯一集約化種植的殺蟲植物。除蟲菊的殺蟲活性物除蟲菊素（pyrethrins）具有高效、低毒、廣譜、低殘留等優(yōu)良殺蟲特性，對人、溫血動物和環(huán)境沒有危害，已成為當(dāng)今無公害生物殺蟲劑的重要研究熱點之一。除蟲菊素主要在除蟲菊花中合成，其含量占整個植株的95%以上，而干花中除蟲菊素含量在1.2-2.0%。目前，天然除蟲菊素已廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、生物農(nóng)藥和食品衛(wèi)生安
3、全等多個領(lǐng)域。但國內(nèi)外對于天然除蟲菊素合成相關(guān)基因的研究很少，從而制約了利用基因工程技術(shù)提高除蟲菊花中除蟲菊素的含量。構(gòu)建除蟲菊花cDNA文庫，可以為今后除蟲菊素合成相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。本研究以除蟲菊花為實驗材料，經(jīng)均一化處理，構(gòu)建了除蟲菊花的均一化cDNA文庫，隨機挑選部分克隆進行EST測序后，進行同源性比較和基因功能分析，得到以下結(jié)論：○1采用試劑盒柱離心法提取除蟲菊花的總RNA，經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的除蟲菊花總RNA有清晰的兩條帶28S與18S，而且兩條帶清晰銳利，沒有拖尾，說明提取總RNA完整，沒有降解。以總RNA為模板，利用SMARTⅣOli
4、gonuleotide和CDS-3Madapter為引物，在PowerScriptReverseTranscriptase作用下合成第一鏈cDNA并且進一步合成雙鏈cDNA，用均一化酶DSN、限制性內(nèi)切酶sfiI處理后，凝膠回收400bp以上的片段，濃縮后與載體pDNR-LIB載體連接，電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，獲得除蟲菊花cDNA原始文庫。原始文庫經(jīng)擴增后，所得擴增文庫置于-80℃超低溫冰箱中保存?！?將得到的原始文庫按比例稀釋后鋪平板并于37℃下過夜培養(yǎng)，計算單菌落數(shù)。得出原始文庫滴度為2.8×105pfu/mL，重組率為96%。利用載體的M13引物進行PCR擴增，得到該文
5、庫的大部分插入片段大小在0.4-1.3kb。采用相同的方法測定cDNA擴增文庫的滴度約為2.0×109pfu/mL?！?從文庫中隨機挑取部分克隆，經(jīng)PCR檢測都有外源插入片段。對65個陽性克隆采用T7作為測序引物，從cDNA5'端進行測序，得到61個EST序列，經(jīng)過比較拼接后有3條序列分別是由2個EST拼接而成，最終得到有效序列58個。○4通過BLASTX與NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的ESTs進行同源性分析表明，所得的58個ESTs序列中有48（82.3%）個具有同源序列，其中40個序列有明確的功能注釋，8個為未知功能基因，有10個（17.2%）ESTs序列未
6、找到I重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要同源序列。關(guān)鍵詞：除蟲菊，SMART技術(shù)，均一化，cDNA文庫，EST序列II重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文英文摘要ABSTRACTPyrethrum(ChrysanthemumCinerariifolium)isaspeciesofperennialherbageplants,andasoleindustrialinsecticidalplantallovertheworld.Becauseofexcellentinsecticidalcharacteristicsofpyrethrins,includinghighefficiency,lowt
7、oxin,broad-spectrum,lowresidues,andalowimpactonthehumanbeingandenvironment,pyrethrinshavebecomeoneofthemostimportantbiologicinsecticides.Thepyrethrinsaremainlysynthesizedinpyrethrumflowersandthecontentismorethan95%.Thecontentinthedriedflowersisabout1.2-2.0%.Atpresen
