眼斑芫菁全長cDNA文庫的構(gòu)建及EST序列分析

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1、重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要摘要眼斑芫菁俗稱黃黑小斑蝥（MylabrisCichoriiLinnaeus），屬于昆蟲綱鞘翅目芫菁科（Coleopter：Meloidae）昆蟲，是中國藥典收錄的重要的動(dòng)物藥之一，近年來因其體內(nèi)所含的斑蝥素（Cantharidin）在臨床醫(yī)學(xué)中有顯著的抗腫瘤作用而使這一資源昆蟲的需求量大為增加，野生資源遠(yuǎn)不能滿足人類需求。目前，對(duì)于芫菁科昆蟲的人工養(yǎng)殖、斑蝥素的合成及應(yīng)用等已有許多研究成果，但是，關(guān)于芫菁科昆蟲的生理學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)方面的研究極為缺乏，有的領(lǐng)域完全是空白，對(duì)芫菁科昆蟲在斑蝥素合成高峰期基因轉(zhuǎn)錄信息的研究能獲取分子昆蟲學(xué)方面的重要信息

2、，為研究芫菁科昆蟲的滯育、斑蝥素生物合成過程等相關(guān)研究開辟新的道路，為實(shí)現(xiàn)芫菁的人工養(yǎng)殖、更好地挖掘芫菁資源乃至斑蝥素的人工合成奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以羽化后25天左右的隔離飼養(yǎng)的雌、雄眼斑芫菁為材料，提取全蟲的mRNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成ss-cDNA，再經(jīng)過LD-PCR技術(shù)合成ds-cDNA，取200bp以上的ds-cDNA與載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化XL1-Blue大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了眼斑芫菁雌、雄成蟲的全長cDNA文庫。從兩個(gè)文庫各隨機(jī)挑取30個(gè)克隆進(jìn)行測序，經(jīng)過處理最終共得到34條ESTs（Expressedsequencetags）序列，經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中包括參與眼斑芫菁

3、重要生理功能的基因。主要研究結(jié)果如下：①成功構(gòu)建了眼斑芫菁雌、雄成蟲的cDNA文庫，經(jīng)檢驗(yàn)文庫質(zhì)量符合要求，可以用來進(jìn)行下一步的研究。②從兩個(gè)cDNA文庫中獲得了部分EST序列，經(jīng)過初步比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)cDNA文庫獲得的EST序列在長度、預(yù)測功能等方面沒有顯著差異。合并雌、雄蟲EST序列進(jìn)行處理，再采用BlastX和BlastN程序與GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，有41%的序列與數(shù)據(jù)庫中的已登錄的基因序列有較高相似性，而有59%的EST序列與數(shù)據(jù)庫中已登錄序列相似性較低。說明眼斑芫菁有著比較獨(dú)特的基因序列，而構(gòu)建文庫是發(fā)現(xiàn)新基因的高效的方法。其中包括細(xì)胞色素C氧化酶等對(duì)于研究眼斑芫菁生理生

4、化具有重要意義的基因序列（序列檢索號(hào)：GW342329至GW342333）。③以眼斑芫菁細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ的基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，證明鞘翅目芫菁科與鞘翅目葉甲科親緣關(guān)系較近，鞘翅目與鱗翅目親緣關(guān)系較近，這個(gè)結(jié)果與傳統(tǒng)的昆蟲分類方法相一致。關(guān)鍵詞：眼斑芫菁，斑蝥素，SMART，cDNA文庫，EST序列I重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文英文摘要ABSTRACTMylabrisCichoriiLinnaeus(Coleoptera:Meloidae)isanimportantChinesetraditionalmedicinelistedinthe

5、ple'sRepublicofChina>editedin2005(abbreviatedastheChinesePharmacopoeia;Ch.P.,2005)whichpotentcontentcantharidinishighlypoisonoustomostofanimals.Foritsextensiveusinginmedicine,therequirementhasupincreasedandthenaturalresourcesofMylabrisCichoriihavebeendramaticallydecreasedinChina.Therearealotofres

6、earchesachievedabouttherearingofMeloidaeinsects,cantharidinsynthesisandapplication.However,ithaslittleresearchaboutMeloidaephysiology,biochemistryandmolecularbiology,andevencompletelyblankinsomefield.Itstranscriptomicdataofcrest-timeofcantharidinbiosynthesiswouldprovideinvaluableinformationformol

7、ecularentomologyandpaveawayforthereserchofdiapauseofMeloidaeinsects,cantharidinbiosynthesisandsoon,anditwouldmakefoundationforachievingtheartificialbreedingofMeloidaeinsects,betterutilizationtheresourcesofcantharidinev