黃瓜根際土壤細(xì)菌群落的16SrDNAPCR-DGGE分析

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1、2015（12）：33-37中國(guó)蔬菜CHINAVEGETABLES研究論文黃瓜根際土壤細(xì)菌群落的16SrDNA-PCR-DGGE分析12，33*32趙柏霞　閆建芳　劉　秋　于基成　趙秀香123（大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，遼寧大連116036；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽110161；大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）摘　要：采用PCR-DGGE技術(shù)分析了接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)黃瓜種植前、接菌前、接菌后發(fā)病、接菌后未發(fā)病以及接種清水（對(duì)照）共5份土壤樣品直接提取其總DNA，用F338-GC/R518引物擴(kuò)增1

2、6SrDNA基因的V3可變區(qū)，結(jié)合DGGE電泳條帶分析樣品的細(xì)菌群落組成及變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，接種枯萎病菌后，會(huì)引起黃瓜根際土壤中細(xì)菌數(shù)量及種類發(fā)生較大的變化，其中，接種枯萎病菌后Rhodococcusphenolicus（E1）、Clostridiumsp.（E3、E6）以及3種未培養(yǎng)細(xì)菌（E2、E4、E5）數(shù)量增加，另外2種未培養(yǎng)細(xì)菌（A1、A2）數(shù)量減少。關(guān)鍵詞：根際微生物；PCR-DGGE；枯萎病菌；細(xì)菌群落黃瓜枯萎病〔Fusariumoxysporum（Schl）f.sp.2009；Chongetal.，2009；劉曉燕等，201

3、4）。cucumerinum〕是黃瓜生產(chǎn)上的一種頑固土傳病害，為揭示枯萎病菌對(duì)黃瓜根際細(xì)菌群落的影響，是目前造成我國(guó)瓜類生產(chǎn)上大面積減產(chǎn)的主要原因本試驗(yàn)以黃瓜根際土壤總DNA為模板，采用PCR-之一，是黃瓜病害中最為嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大DGGE分析方法監(jiān)測(cè)接種枯萎病菌后黃瓜根際土的病害之一（張宏宇等，2010，閆霜等，2011）。壤細(xì)菌的變化，試圖闡述在枯萎病菌影響條件下其致病菌可以在土壤中存活多年，給該病害的防治土壤細(xì)菌群落的演替規(guī)律，為從根際微生物生態(tài)帶來很大的困難。黃瓜枯萎病的發(fā)生及發(fā)病程度的角度理解枯萎病問題，進(jìn)而為開展生物防治奠定輕重，是病原

4、菌和土壤中各種微生物相互作用的基礎(chǔ)。結(jié)果（鄧曉等，2012）。土壤微生物多樣性與植物1　材料與方法土傳病害抑制水平密切相關(guān)，根際微生物在抑制土傳病害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)過程中具有重要的作用1.1　材料（Garbevaetal.，2004a，2004b；申衛(wèi)收和林先貴，1.1.1　供試病原菌　試驗(yàn)所用的黃瓜枯萎病2011）。PCR-DGGE技術(shù)作為一種指紋分析技術(shù)，病原菌——尖孢鐮孢菌黃瓜專化型（Fusarium適合用來分析環(huán)境微生物種群多樣性。近些年來，oxysporumf.sp.cucumerinum），由大連民族大學(xué)實(shí)DGGE技術(shù)已經(jīng)在環(huán)境微生物研

5、究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用驗(yàn)室保存。（李懷等，2008；馬俊孝等，2008；潘雪蓮等，1.1.2　供試土壤樣品采集　試驗(yàn)田設(shè)在大連民族大學(xué)的溫室內(nèi)，2012年4月，將從大連當(dāng)?shù)胤N子店趙柏霞，女，助理研究員，博士，主要從事土壤微生物與植物病理方面的研究，E-mail:zhaobaixia1979@126.com購(gòu)買的黃瓜品種碧秀的種子催芽后，播種在直徑*通訊作者（Correspondingauthor）：劉秋，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主30cm的大花盆中。待黃瓜3～4片葉時(shí)，接種黃瓜要從事微生物學(xué)研究，E-mail:liuqiutougao@sina.co

6、m枯萎病菌。采用抖落法（張學(xué)利等，2005）分別收稿日期：2015-01-30；接受日期：2015-05-21采集黃瓜種植前的土壤（ZQ，4月18日取樣）、接基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070005，21276047，種黃瓜枯萎病菌前的土壤（JQ，5月20日取樣）、31270057，31101477），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)自主基金青年項(xiàng)目（DC13010309，DC12010103）接菌后感染枯萎病菌的黃瓜根際土壤（JB，6月17—33—《中國(guó)蔬菜》學(xué)術(shù)論文下載www.cnveg.org研究論文中國(guó)蔬菜CHINAVEGETABLES日取樣

7、）、接菌后未發(fā)病的黃瓜根際土壤（JJ，6月小約為1500bp的目的片段（圖2），PCR產(chǎn)物的特17日取樣）及接種清水的黃瓜根際土壤（CK，6異性較好。第2輪PCR反應(yīng)以F338-GC/R518為引月17日取樣）共5份黃瓜根際土壤樣品。每份樣物，擴(kuò)增得到大小約為230bp的目的片段（圖3）。品由5株黃瓜根際土壤充分混勻。樣品取回后置于M12345678910陰涼通風(fēng)處干燥，過20目篩后備用。1.2　方法23.1kb1.2.1　樣品總DNA的提取　采用堿裂解法提取供試土壤樣品總DNA（Huetal.，2010），用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，以λ-H

8、indⅢ作為Marker。圖1　根