黃瓜根際土壤細菌群落的16SrDNAPCR-DGGE分析

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1、2015(12):33-37中國蔬菜CHINAVEGETABLES研究論文黃瓜根際土壤細菌群落的16SrDNA-PCR-DGGE分析12,33*32趙柏霞 閆建芳 劉 秋 于基成 趙秀香123(大連市農(nóng)業(yè)科學研究院,遼寧大連116036;沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,遼寧沈陽110161;大連民族大學生命科學學院,遼寧大連116600)摘 要:采用PCR-DGGE技術(shù)分析了接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細菌群落的動態(tài)變化。對黃瓜種植前、接菌前、接菌后發(fā)病、接菌后未發(fā)病以及接種清水(對照)共5份土壤樣品直接提取其總DNA,用F338-GC/R518引物擴增1

2、6SrDNA基因的V3可變區(qū),結(jié)合DGGE電泳條帶分析樣品的細菌群落組成及變化趨勢。結(jié)果顯示,接種枯萎病菌后,會引起黃瓜根際土壤中細菌數(shù)量及種類發(fā)生較大的變化,其中,接種枯萎病菌后Rhodococcusphenolicus(E1)、Clostridiumsp.(E3、E6)以及3種未培養(yǎng)細菌(E2、E4、E5)數(shù)量增加,另外2種未培養(yǎng)細菌(A1、A2)數(shù)量減少。關(guān)鍵詞:根際微生物;PCR-DGGE;枯萎病菌;細菌群落黃瓜枯萎病〔Fusariumoxysporum(Schl)f.sp.2009;Chongetal.,2009;劉曉燕等,201

3、4)。cucumerinum〕是黃瓜生產(chǎn)上的一種頑固土傳病害,為揭示枯萎病菌對黃瓜根際細菌群落的影響,是目前造成我國瓜類生產(chǎn)上大面積減產(chǎn)的主要原因本試驗以黃瓜根際土壤總DNA為模板,采用PCR-之一,是黃瓜病害中最為嚴重、造成經(jīng)濟損失最大DGGE分析方法監(jiān)測接種枯萎病菌后黃瓜根際土的病害之一(張宏宇等,2010,閆霜等,2011)。壤細菌的變化,試圖闡述在枯萎病菌影響條件下其致病菌可以在土壤中存活多年,給該病害的防治土壤細菌群落的演替規(guī)律,為從根際微生物生態(tài)帶來很大的困難。黃瓜枯萎病的發(fā)生及發(fā)病程度的角度理解枯萎病問題,進而為開展生物防治奠定輕重,是病原

4、菌和土壤中各種微生物相互作用的基礎。結(jié)果(鄧曉等,2012)。土壤微生物多樣性與植物1 材料與方法土傳病害抑制水平密切相關(guān),根際微生物在抑制土傳病害和促進植物生長過程中具有重要的作用1.1 材料(Garbevaetal.,2004a,2004b;申衛(wèi)收和林先貴,1.1.1 供試病原菌 試驗所用的黃瓜枯萎病2011)。PCR-DGGE技術(shù)作為一種指紋分析技術(shù),病原菌——尖孢鐮孢菌黃瓜?;停‵usarium適合用來分析環(huán)境微生物種群多樣性。近些年來,oxysporumf.sp.cucumerinum),由大連民族大學實DGGE技術(shù)已經(jīng)在環(huán)境微生物研

5、究領(lǐng)域中廣泛應用驗室保存。(李懷等,2008;馬俊孝等,2008;潘雪蓮等,1.1.2 供試土壤樣品采集 試驗田設在大連民族大學的溫室內(nèi),2012年4月,將從大連當?shù)胤N子店趙柏霞,女,助理研究員,博士,主要從事土壤微生物與植物病理方面的研究,E-mail:zhaobaixia1979@126.com購買的黃瓜品種碧秀的種子催芽后,播種在直徑*通訊作者(Correspondingauthor):劉秋,女,教授,碩士生導師,主30cm的大花盆中。待黃瓜3~4片葉時,接種黃瓜要從事微生物學研究,E-mail:liuqiutougao@sina.co

6、m枯萎病菌。采用抖落法(張學利等,2005)分別收稿日期:2015-01-30;接受日期:2015-05-21采集黃瓜種植前的土壤(ZQ,4月18日取樣)、接基金項目:國家自然科學基金項目(31070005,21276047,種黃瓜枯萎病菌前的土壤(JQ,5月20日取樣)、31270057,31101477),中央高校基本科研業(yè)務費自主基金青年項目(DC13010309,DC12010103)接菌后感染枯萎病菌的黃瓜根際土壤(JB,6月17—33—《中國蔬菜》學術(shù)論文下載www.cnveg.org研究論文中國蔬菜CHINAVEGETABLES日取樣

7、)、接菌后未發(fā)病的黃瓜根際土壤(JJ,6月小約為1500bp的目的片段(圖2),PCR產(chǎn)物的特17日取樣)及接種清水的黃瓜根際土壤(CK,6異性較好。第2輪PCR反應以F338-GC/R518為引月17日取樣)共5份黃瓜根際土壤樣品。每份樣物,擴增得到大小約為230bp的目的片段(圖3)。品由5株黃瓜根際土壤充分混勻。樣品取回后置于M12345678910陰涼通風處干燥,過20目篩后備用。1.2 方法23.1kb1.2.1 樣品總DNA的提取 采用堿裂解法提取供試土壤樣品總DNA(Huetal.,2010),用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗,以λ-H

8、indⅢ作為Marker。圖1 根

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