實驗一蛋白質(zhì)的定量測定

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1、實驗一蛋白質(zhì)的定量測定——Folin-酚試劑法(Lowry法)蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)（一）雙縮脲反應(yīng)是由兩分子尿素縮合成一種化合物的反應(yīng)。2尿素雙縮脲+氨180度雙縮脲在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色絡(luò)合物，這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紫紅色或藍紫色絡(luò)合物。通常可用此法來定性鑒定蛋白質(zhì)的存在，也可根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，在540nm波長處進行比色，定量測定蛋白質(zhì)的濃度。允許測定范圍為0.2-1.7mg蛋白質(zhì)/ml。（二）蛋

2、白質(zhì)的黃色反應(yīng)芳香族氨基酸特別是酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng)。蛋白質(zhì)遇硝酸后，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成黃色，再加堿，顏色加深呈橙黃色。（三）酚試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。（四）乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基結(jié)構(gòu)的化合物都有這一反應(yīng)。（五）坂口反應(yīng)精氨酸分子中所含量胍基能與次溴酸鈉（或次氯酸鈉）及α-萘酚在堿性溶液中形成紅色產(chǎn)

3、物。（六）米倫反應(yīng)（Ｍillon）米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸、亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變?yōu)榧t色。酚類化合物有此反應(yīng)。常用的蛋白質(zhì)定量測定的方法凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚法紫外（UV）分光光度法考馬斯亮蘭染色法一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理。2.掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。二、實驗原理Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條

4、件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測定酪氨酸和色氨酸的含量。進行測定時要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質(zhì)含量高時（25-100μg）在500nm波長處進行測定，含量低時(5-25μg)在755nm波長處進行測定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。此法的優(yōu)點是：操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫

5、外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可以穩(wěn)定幾個小時。缺點是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測定時應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗消除。此法是在Folin—酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin—酚反應(yīng)。此外，所測的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右

6、），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對顯色無影響，這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉—氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉—氫氧化鈉濃度1—2倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。三、實驗材料（一）實驗器材100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；722型分光光度計。（二）實驗試劑試劑甲：1)4%碳酸鈉溶液2)0.2mol/L氫氧化鈉溶液3

7、)1%硫酸銅溶液4)2%酒石酸鉀鈉溶液。臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉—氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin—酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。試劑乙：稱鎢酸鈉（Na2WO2?2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25g置2000ml磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700ml，85%磷酸50ml和濃硫酸100ml。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸

8、鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000ml，過濾即成Folin-酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時即為滴定終點。該試劑的酸度