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1、紫杉醇前體依賴于MEP途徑合成的分子調(diào)控機(jī)理Ⅱ—TcMCT和TcMCS基因的克隆與功能研究植物學(xué)專業(yè)碩士研究生楊穎舫指導(dǎo)教師廖志華教授西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2010年6月4日星期六8/14/2021目錄研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線2研究結(jié)果與分析3結(jié)論與展望4背景概況及目的18/14/2021南方紅豆杉的概況種名：南方紅豆杉學(xué)名：Taxuschinese別名：刺柏松，紫杉，紫柏松科屬：紅豆杉科、紅豆杉屬保護(hù)等級(jí)：國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物（國(guó)務(wù)院1999年８月４日批準(zhǔn)）產(chǎn)地分布：產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中，星散分布.背景概況及目的8
2、/14/2021為什么要研究紅豆杉世界衛(wèi)生組織（WHO）2008年12月9日發(fā)布報(bào)告稱2010年，癌癥將超越心臟病成為全球頭號(hào)殺手。 而吸煙、攝入過(guò)多高脂肪食品、人口老齡化以及世界人口持續(xù)增長(zhǎng)等因素是造成癌癥患者與日俱增的原因。WHO預(yù)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會(huì)以每年1％的速度遞增，而在中國(guó)、俄羅斯和印度這些國(guó)家增長(zhǎng)速度會(huì)更快。報(bào)告說(shuō)：“全球癌癥患者在上世紀(jì)最后30年里翻了一番，估計(jì)這一數(shù)字在2020年前將再翻一番，2030年前將增至上世紀(jì)最后30年的3倍。”這意味著到2030年，全球?qū)⑿略?700萬(wàn)癌癥病例，死于癌癥的人數(shù)將達(dá)
3、到1700萬(wàn)人。背景概況及目的8/14/2021紫杉醇一種高效的抗癌藥物紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種四環(huán)二萜化合物,也是目前所了解的一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。紫杉醇是一種有絲分裂抑制劑，使腫瘤細(xì)胞停止在G2期和M期，直至死亡，進(jìn)而起到抗腫瘤作用。紫杉醇還可調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能，對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷或抑制作用。通過(guò)Ⅱ-Ⅲ臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤有一定療效。紫杉醇分子式：C47H51NO14物理性質(zhì)：白色結(jié)晶體粉末。無(wú)臭，無(wú)味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。背景概況及目的8
4、/14/2021紫杉醇合成研究傳統(tǒng)育種技術(shù)培育紅豆杉栽培品種紫杉醇的化學(xué)全合成和半合成分離培養(yǎng)與紅豆杉共生的產(chǎn)紫杉醇微生物利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇利用基因工程遺傳改良周期長(zhǎng)效率低步驟長(zhǎng)產(chǎn)率低副產(chǎn)物多含量低菌種易衰退產(chǎn)量低（1）紅豆杉離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的成功，為利用基因工程技術(shù)遺傳改良紅豆杉奠定了良好的實(shí)踐基礎(chǔ)；（2）把植物次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)胫参锘蚱渌锓N中高效表達(dá)用于生產(chǎn)有用的次生代謝物質(zhì)有諸多成功報(bào)道。優(yōu)勢(shì)背景概況及目的8/14/2021紫杉醇生物合成的上游代謝途徑2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶2-C-甲基赤蘚醇-2，
5、4-環(huán)焦磷酸合成酶背景概況及目的8/14/2021紫杉醇生物合成的下游代謝途徑背景概況及目的8/14/2021基于RACE技術(shù)的同源性克隆方法克隆了南方紅豆杉中的兩個(gè)基因（MCT和MCS）TcMCT和TcMCS基因的功能驗(yàn)證TcMCT基因的原核表達(dá)和酶活測(cè)定TcMCT基因的組織差異表達(dá)研究?jī)?nèi)容8/14/2021技術(shù)路線8/14/2021ABCTcMCT基因的獲得研究結(jié)果與分析基因克隆8/14/2021TcMCT全長(zhǎng)cDNA序列及編碼的氨基酸序列質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽全長(zhǎng)：1293-bpORF：942-bp5端非編碼區(qū)：58-bp3端：249-bp編碼313個(gè)氨基酸分
6、子量約為34.3kDa等電點(diǎn)：8.96研究結(jié)果與分析基因克隆8/14/2021h表示α-螺旋，e表示β-片層，t表示β-轉(zhuǎn)角，c表示隨意卷曲；30.13%的α-螺旋、21.15%β-片層、8.97%β-轉(zhuǎn)角和39.74%隨意卷曲構(gòu)成。TcMCT蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因克隆研究結(jié)果與分析8/14/2021“★”表示CTP結(jié)合位點(diǎn)TcMCT氨基酸序列多重比對(duì)紅框表示MEP的結(jié)合位點(diǎn)TcMCT分別與銀杏(Ginkgobiloba)的MCT、和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的MCT具有較高的同源性，同源性分別為59.3%、56.9%，相似性分別
7、為69.1%、65.5%。研究結(jié)果與分析基因克隆8/14/2021細(xì)菌來(lái)源MCT用○表示；植物來(lái)源用三角表示，其中被子植物用▲表示，裸子植物用△表示。分支上的數(shù)字為Bootstrap值(重復(fù)1000次)。TcMCT系統(tǒng)進(jìn)化樹基因克隆研究結(jié)果與分析8/14/2021TcMCT三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)α-螺旋用紅色螺旋狀表示，β-片層用藍(lán)色板狀表示，隨機(jī)卷曲用灰色繩狀表示。鋅離子結(jié)合位點(diǎn)用不同顏色小球標(biāo)注出基因克隆研究結(jié)果與分析TcMCT具有兩個(gè)高度保守的活性位點(diǎn)底物MEP結(jié)合位點(diǎn)：Arg102-Lys109底物CTP結(jié)合位點(diǎn)：Arg239-Lys2958/14/202
8、1TcMCT基因的功能驗(yàn)證功能驗(yàn)證利用攜帶有pAC-BETA質(zhì)粒的大腸桿菌菌株X
