淋巴細胞亞群分析

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1、淋巴細胞亞群分析（一）雙色分析方案CD45-FITC/CD14-PE;CD3-TC-CD4-PE-CD8-FITC;CD3-FITC/CD（l6+56）-PE;CD19-TC;Cal-Lyse;ControlIgG2a-FPTo結果見表2-3-1o（二）三色分析方案表2-3-1雙色法檢測外周血T細胞、B細胞、NK細胞試劑組合管號FITCPE應用12345CD45CD3CD3CD3CD3CD14CD19CD4CD8CD16和CD56光散射坐標設門總T和B淋巴細胞總T和CD4陽性T淋巴細胞總T和CD8陽性T淋巴細胞總T和NK細胞A管：CD45/CD14確定FSC/S

2、SC中淋巴細胞“門”位置，對于自配溶血劑用戶必做此質控管。B管：陰性對照管，用來設置各PMT電壓和陰性區(qū)域。C管：CD3/CD4/CD8三色檢測管，調節(jié)熒光補償之用。D管：CD3/CD(16+56)/CD19三色檢測管。結果見表2-3-2o表2?3?2三色法檢測外周血T細胞、B細胞、NK細胞的試劑組合管號FITCPE應用123CD45CD8CD3CD14CD4CD16和CD56光散射坐標設“門”總T細胞及其亞群NK細胞及B細胞CD45和CD14在口細胞上有著不同的表達。它們可以用來在光散射坐標上區(qū)分淋巴細胞群體或其他細胞。一個適合的分型方案應能夠提供最精確的方法

3、，明確地區(qū)分出各類細胞群。方案中所選抗體應能夠最大限度地反映出整個標本中細胞的信息，提供樣本管Z間的對比質控來作陽性標本熒光強度對照。美國疾病控制中心(CDC)制定了一套檢測T淋巴細胞亞群的方案，可作為參照來檢測樣木。(三)應用CD3/CD19區(qū)分T淋巴細胞和B淋巴細胞在多色免疫分型的細胞分型中，陰性細胞群體不僅用來區(qū)分陽性細胞群體，它還可以從雙陽性細胞屮區(qū)分出單陽性細胞。有鑒于此，簡單的同型對照細胞并不能完全作為設定熒光陽性界線的參考細胞群。在CDC推薦的淋巴細胞分型方案中，對照細胞群體運用的是相互沒有交叉的T、B淋巴細胞。(1)CD3是T細胞特異性抗原，CD

4、19則可用來識別B細胞。如運用CD3/CD19雙標試劑，應沒有CD3和CD19雙陽性細胞群體存在。因此，當運用CD3/CD19雙染色時，只會出現(xiàn)單陽性細胞，通過此管可設定機器設置，為后續(xù)要觀察雙陽性細胞的檢測管作對照。(2)CD3、CD19陽性表達為獨立的陽性細胞群體。如出現(xiàn)雙陽性細胞均視為假象。這樣就可不用同型對照來設定陰性或陽性界線。其屮單陽性細胞群體提供了設定陽性界線的標準。此外，在CD3/CD19檢測時，還會有雙陰性細胞群體的存在，這些是NK細胞。這些細胞乂提供雙陰性群體的對照。有吋檢測吋會出現(xiàn)雙陽性細胞，這是由于T細胞和B細胞黏附時同時通過儀器的檢測區(qū)

5、而造成的雙陽性結果。(1)CD3/CD19不僅可用來設定標木的熒光的陰性和陽性界線，它還可用來檢查儀器的補償設置和非特異性結合。在用這個組合進行檢測時，會出現(xiàn)三群彼此獨立的細胞群，如細胞分群不清或位置發(fā)生偏差則要對樣本進行仔細分析。(三)應用CD3/CD4來鑒定CD4+T淋巴細胞如同其他許多單克隆抗體一樣，抗CD4抗體并不是完全只與輔助/誘導性T細胞發(fā)生反應，它還會與單核細胞結合。因此，如要鑒別CD4+的輔助/誘導性T細胞，則需要加入第二種抗體來區(qū)分輔助/誘導性T細胞與單核細胞。⑴首先用CD3來區(qū)分全部T細胞。CD3/CD4雙陽性的細胞為真正的輔助/誘導性T細胞

6、。這些細胞主要是HIV病毒感染對象。在HIV感染后，隨著疾病的發(fā)展出現(xiàn)免疫抑制后，這群細胞會明顯減少;在臨床中，對HIV的監(jiān)測主要依靠檢測這群細胞的數(shù)量。(2)CD3?/CD4+細胞群體是由單核細胞組成的。這些細胞和對于CD4+和T細胞來說弱表達CD4,在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。CD3/CD4抗體組合能完全將CD4陽性輔助/誘導性T細胞與CD4陽性的單核細胞區(qū)分開來。因為CD4+T細胞能與單核細胞完全分離，故在光散射坐標上設淋巴細胞“門”時，“門”可設得大一些，即使包含了單核細胞或其他細胞都不會影響檢測值。(3)此管也可檢測補償及非特異性結合情況°CD3+/

7、CD牛細胞群體應明顯地與CD3/CD19中CD3+細胞群位置相重合。(三)應用CD3/CD8鑒定CD8+T淋巴細胞CDS的表達不只限于細胞毒性/抑制性T細胞，這種抗原在部分NK細胞上也能檢測到，故CD8必須與CD3一起來鑒定細胞毒性/抑制性T細胞。(1)同時表達CD3/CD8的細胞群才是真正的CD8+T淋巴細胞，CD8的表達包括弱陽性和強陽性部分。CD8的表達經(jīng)常與陰性細胞群體相延續(xù)。因此，CD8陽性細胞檢測群依賴于儀器靈敏度，正確補償?shù)慕?，以及恰當?shù)卦O定陰性細胞群體。CD3-/CD84-細胞包括一部分NK細胞和少數(shù)粒細胞。這些細胞弱表達CD8+,由于缺少CD

8、3,易于與CD3+/CD