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《分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用ISSR》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、Chapter10ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)在SSR標(biāo)記技術(shù)中，采用PCR反應(yīng)必須知道擴增DNA片段兩側(cè)序列，在大多數(shù)情況下，某些序列本身或其旁測序列并不清楚，而且由于SSR兩側(cè)引物具有物種特異性，引物設(shè)計費時耗力，要檢測多個基因座是不現(xiàn)實的。這就限制了PCR技術(shù)的應(yīng)用，“錨定PCR（anchoredPCR）”可克服上述障礙。錨定簡單重復(fù)序列（anchoredsimplesequencerepeat，ASSR），也稱作簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simplesequencerepeat，ISSR）
2、標(biāo)記技術(shù)或者以微衛(wèi)星為引物的PCR（microsatellite-primedPCR,MP-PCR）技術(shù)。10.1IntroductionISSR標(biāo)記技術(shù)由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等于1994年提出。用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2～4個隨機核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可以引起特定位點退火，導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進行PCR擴增。所擴增的interSSR區(qū)域的多個條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辨，擴增帶多為顯性表現(xiàn)。10.2Princi
3、pleofISSR錨定ISSR-PCR示意圖5′錨定引物NNNN(CA)n3′錨定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5′錨定引物NNNN(CA)n3′錨定引物NN(CA)n3′錨定引物的PCR產(chǎn)物5′錨定引物的PCR產(chǎn)物用重復(fù)序列(CA)n作單引物，在引物的5′端或3′錨定1至數(shù)個堿基。ISSR遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好。（17～24bp）符合孟德爾遺傳規(guī)律。無需知道任何靶標(biāo)序列的S
4、SR背景信息。DNA用量少10.3CharacteristicAdvantages：PCR擴增反應(yīng)的最適條件需要一定時間摸索。ISSR標(biāo)記大多是顯性標(biāo)記disadvantages：DNAextractionandpurification10.4ProcedurePrimerdesignISSR引物常為5′端或3′加貓（2～4個堿基）的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸序列，重復(fù)次數(shù)常為4～8次。PCRamplification6％PAGEDetectofPCRproductandstatisticalanalysis擴增步驟與RAPD相似，但
5、不同引物、不同材料的擴增條件有異。Primer0.2～0.8μmol/LTemplateDNA5～50ngTaqDNApolymerase0.4～1U需要做預(yù)備實驗優(yōu)化PCR條件，以獲得清晰、可重復(fù)，易統(tǒng)計的條帶。25μl0.5～2.0%AgarosegelelectrophoresisEBstainingSilverstainingyes1No0PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括
6、引發(fā)劑和另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑和加速劑的配伍如下表：聚合反應(yīng)催化劑配伍引發(fā)劑加速劑（NH4)2S2O8TEMED（NH4)2S2O8DMAPN核黃素TEMEDNote：(NH4)2S2O8，過硫酸胺TEMED：N，N，N，N‘;四甲基乙二胺DMAPN：β－二甲基胺基丙晴用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強光照射反應(yīng)液，稱光聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響1、大氣中氧能淬滅自由基，使
7、聚合反應(yīng)終止，所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。2、某些材料如有機玻璃，能抑制聚合反應(yīng)。3、某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢。以上幾點在制備凝膠時必須加以注意。PouringAcrylamideGelsPreparationofglassplatesWashtheglassplatesthoroughlyinwaterandsoapwithasponge.RinsewithdH2O,anddrywithpapertowels.Rubtheshortplatewith95%ethanol.Disp
8、erse1mlbind-silaneontheglassplateandletitdryfor5min.Rubtheplatewithawet(ddH2O)papertowel.Rinsetheplatew
