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1、豬圓環(huán)病毒檢測(cè)技術(shù)相關(guān)探究摘要：豬圓環(huán)病毒能引起豬圓環(huán)病，對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、原位核酸雜交試驗(yàn)、電鏡檢查等檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。檢測(cè)豬圓環(huán)病毒是屬于圓環(huán)病毒屬，圓環(huán)病毒科其DNA為單鏈，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。癥狀為：腹瀉、呼吸困難、皮膚蒼白、漸進(jìn)性消瘦和體質(zhì)下降，現(xiàn)對(duì)研究情況進(jìn)行綜述。1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法1.1常規(guī)PCR由于常規(guī)PCR檢測(cè)有著快速、簡(jiǎn)便、特異性高的特點(diǎn)，它成為了常用的檢測(cè)方法。我們從細(xì)胞及組織中直接用水煮法提取核酸，根據(jù)PCV2的基因序列來(lái)設(shè)計(jì)出其PCR引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，這種操作簡(jiǎn)單，有時(shí)存在假陽(yáng)性P
2、CR污染的現(xiàn)象。1.2套式PCR需要節(jié)省模版和需要高敏感性時(shí)可以選用套式PCR,即：外側(cè)引物為647bp和內(nèi)側(cè)引物219bp,將這2種引物擴(kuò)增2次將外側(cè)引物的DNA含量擴(kuò)增到5?10mg/mLo趙浩軍等根據(jù)套式PCR檢測(cè)方法，利用這2對(duì)PCV2特異性引物，對(duì)656份臨床發(fā)病的淋巴結(jié)和肺樣品進(jìn)行了PCV檢測(cè)，結(jié)果有30份樣品檢測(cè)出PCV,其平均陽(yáng)性率比普通的PCR檢測(cè)靈敏度高。杭柏林等（2008）根據(jù)GenBank中PCV2的核昔酸序列，成功設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物，從而建立一種檢測(cè)地方分離株P(guān)CV2的PCR方法口］。1.3熒光定量PCR檢測(cè)PCV-2的方法還有熒光定量
3、PCR技術(shù)，McintoshKA等利用該方法成功的從腸系膜淋巴結(jié)、血清、心肌層、肝臟、糞便、腎臟中檢測(cè)出PCV-2o2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（E口SA）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的流程為：包被一添加待測(cè)抗體，再加酶標(biāo)記抗體，使之生成抗原■待測(cè)抗體■酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物-將復(fù)合物與該酶的底物反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物一利用分光光度計(jì)來(lái)計(jì)算抗體的量，待測(cè)抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。ELISA最常用的方法有：競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原、間接法測(cè)定抗體、雙抗體夾心法測(cè)定抗原。因?yàn)镋LISA檢測(cè)方法適合大規(guī)模的檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、特異性高、敏感性高的特點(diǎn)，非常適合血清學(xué)檢測(cè)。郎洪武等通過(guò)該法對(duì)豬血清感染PCV2的48
4、4份血清進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)的結(jié)果說(shuō)明，該法能夠?qū)ωi圓環(huán)病毒進(jìn)行大規(guī)模的檢測(cè)，其敏感性高于免疫熒光方法［2］。3間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IIF）該方法用于PCV的定型和檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)豬血清中的PCV抗體，就能確定豬是否存在PCV的感染以及感染的程度。但是這種方法不能區(qū)分該抗體到底是屬于哪種抗體，陳慶新等對(duì)杭州地區(qū)28個(gè)豬場(chǎng)的豬，利用間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血清中的PCV抗體，通過(guò)比較各種反應(yīng)物的濃度及反應(yīng)的時(shí)間，建立了PCV抗體的間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù),此方法可用于PCV抗體水平的檢測(cè)［3］。4原位核酸雜交試驗(yàn)（ISH）在該方法中，應(yīng)用的加強(qiáng)快速雜交方法比傳統(tǒng)的雜交方法檢測(cè)時(shí)間大大縮
5、短，更加適合于PCV的檢測(cè)，其在細(xì)胞中能精確地確定PCV病毒DNA的位置，而且敏感性高。姚鑫等利用該方法檢測(cè)臨床組織中的PCV與PCR基本一致，建立了直接從細(xì)胞和組織中檢測(cè)和定位PCV的原位雜交檢測(cè)方法。5電鏡檢查對(duì)豬圓病毒進(jìn)行檢查時(shí)，利用電鏡觀察病毒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染病毒的細(xì)胞中有大量的散在細(xì)胞漿內(nèi)包涵體，這些包涵體由大量的直徑為20nm的電子致密顆粒組成，其排列方式為晶體狀，在電鏡下能看到負(fù)染后的含有感染PCV病豬的提取物的病毒顆粒。在我國(guó)豬群感染豬圓環(huán)病毒上升速度快，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，到目前為止沒有能控制該病的有效疫苗，這就需要我們發(fā)展特異性高、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速
6、的檢測(cè)方法，這是我們研究的重點(diǎn)。雖然建立了多種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的方法，但是單一的檢測(cè)還不能解決所有的問題，研究出一種快速、靈敏、特異、檢出率高的方法，是我們的當(dāng)務(wù)之急。參考文獻(xiàn)[1]郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥血清抗體檢測(cè).中國(guó)獸醫(yī)科技，2000(3):3-5.[2]陳慶新，商紹彬，葉菊秀，等.杭州地區(qū)豬II型環(huán)病毒抗體的血清學(xué)調(diào)查?中國(guó)獸醫(yī)科技,2003,33(7):26-28.[3]姚鑫，楊漢春，郭鑫，等.豬圓環(huán)病毒2型原位雜交檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用?畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007(2):169-174.畢業(yè)論文
