水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變基因gry79的圖位克隆.pdf

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)Map-basedCloningofthegz'yZ9MutantGeneControllingGreen-revertibleyellowLeafinRiceByWanChunmeiDirectedbyProf．DengXiaojiaSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofInSichuanAgriculturalUniversity(Cropgeneticsandbreeding)Wenjiang611130S

2、ichu鋤P．R．ChinaJune2014萬(wàn)方數(shù)據(jù)附件一論文獨(dú)創(chuàng)性聲明IHIIIIImhllUllltlmllIIIJ0120563本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生戤湯秘關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明伊／悔6

3、月卜日f(shuō)本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生鼢湯被導(dǎo)師簽名：鄧叱吐知，p多占良I汨知，lID阜6d-五日萬(wàn)方數(shù)據(jù)水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變基因gry79的圖位克隆摘要水稻(Oryzasativa)是我國(guó)重要的糧食作物之一，也是研究植物功能基因組學(xué)的單子葉模式植物。而葉色突

4、變是水稻中比較常見(jiàn)的一種突變類型，在研究植物光合作用的生理生化機(jī)制、水稻基因功能以及遺傳育種應(yīng)用等各方面都具有重要的價(jià)值。為了明確水稻黃化轉(zhuǎn)綠突變體刪79鋤．revertibleyellow79)的表型特征和遺傳特性以及突變基因的功能，本研究對(duì)該突變材料進(jìn)行了表型特征的調(diào)查、主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查和葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察，并對(duì)突變基因進(jìn)行了分子標(biāo)記定位、圖位克隆、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證、熒光定量等分析。主要研究結(jié)果如下：利用甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate，EMS)對(duì)粳稻日本晴的一個(gè)遲熟突

5、變體卻·J進(jìn)行誘變，得到一個(gè)黃化轉(zhuǎn)綠突變體gry79，該突變體在三葉期以前表現(xiàn)為黃綠葉，第四葉開(kāi)始逐漸轉(zhuǎn)綠，六葉期以后恢復(fù)到正常綠色。盡管突變體gry79植株在苗期生長(zhǎng)緩慢，但它的抽穗期比野生型親本(tvpl)推遲僅1．4d。在成熟期，除了每株有效穗數(shù)比野生型下降15．2％：9b，突變體的株高、每穗著粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重與野生型差異并不顯著。光合色素含量的測(cè)定結(jié)果顯示，gry79突變體在三葉期的Chla、Chlb、總Chls含量和類胡蘿卜素分別減少了76．4％、76．9％、76．5％和58．1％。透

6、射電子顯微鏡結(jié)果顯示，野生型中的葉綠體有著發(fā)育完整的由基粒組成的膜系統(tǒng)，而gry79突變體的葉綠體中的基粒松散并且類囊體膜發(fā)育不完善，并且葉綠體所含淀粉粒較少，表明突變體的葉綠體的發(fā)育在幼苗早期受到抑制。遺傳分析表明該黃化轉(zhuǎn)綠突變性狀是受一對(duì)隱性核基因控制的。以gry79突變體與正常綠葉表型的浙輻802雜交得到的F2代作為定位群體，將gry79突變基因精細(xì)定位于水稻第2染色體長(zhǎng)臂上的InDel標(biāo)記W4與W5之間的71kb染色體區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域含有8個(gè)預(yù)測(cè)基因。從gry79突變體及野生型親本中分別擴(kuò)增出

7、這8個(gè)預(yù)測(cè)基因并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示gry79突變體內(nèi)僅Os02933610發(fā)生了突變，其余7個(gè)基因均未見(jiàn)突變。Os02933610基因全長(zhǎng)7492bp，有17個(gè)內(nèi)含子和18個(gè)外顯子，CDS全長(zhǎng)長(zhǎng)2616bp，編碼一個(gè)含871個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。i萬(wàn)方數(shù)據(jù)在gry79突變體中，該基因序列在第4209位堿基(位于第11外顯予)由C突變成T，使CDS第1160位堿基由C突變成T。導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)第387位氨基酸由絲氨酸(Ser或S)突變成苯丙氨酸(Phe或F)。因此將該基因確定為引起gry79黃化突變的候選基

8、因，暫命名為GRY79基因。搜索水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示GRY79是一個(gè)單考貝基因，編碼一個(gè)分子量約96kDa的蛋白質(zhì)。GRY79蛋白在N．端含有一個(gè)由36個(gè)氨基酸殘基組成的葉綠體靶序列，同時(shí)該蛋白質(zhì)還在N一端含有一個(gè)由202個(gè)氨基酸殘基組成的金屬一p一內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)域(metallo．p．1actamasedomain)，在C．端含有一個(gè)由66個(gè)氨基酸殘基組成的三螺旋DNA結(jié)合域(trihelixDNAbindingdomain)。多氨基酸序列比對(duì)顯示，GRY79蛋