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1、南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)JOURNALOFSOUTHERNAGRICULTURE2013,44(9):1558—1563ISSN2095—1191;CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.cnDOI:10.3969/j:issn.2095—1191.2013.9.1558廣西巴馬小型豬儀干擾素基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建吳丹L2,蘭干球-,郭亞芬-,陳寶劍1,陳少梅1,蔣欽楊1+(1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧530005;2桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣西桂林541002)摘要:【目的】克隆廣西巴馬小型豬ot干擾素基因(polFN-a)全部
2、編碼序列并構(gòu)建其ntH孚L動(dòng)物真核表達(dá)載體,為研發(fā)重組豬干擾素類免疫佐劑及生物治療制劑提供參考依據(jù)。【方法】應(yīng)用RT—PCR擴(kuò)增廣西巴馬小型豬polFN-a編碼序列,鏈接至pMDl8-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,以測(cè)序正確的重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的polFN-a基因,然后連接真核表達(dá)載體pTARGET構(gòu)建重組表達(dá)載體pTARGET—polFN—ot,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,經(jīng)雙酶切初步鑒定正確后送至北京諾賽生物有限公司測(cè)序,用DNASTAR軟件及PrimerPremer5.0等對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行分析。【結(jié)果】以廣西巴馬小型豬總RNA為模板擴(kuò)增獲
3、得的目的片段為618bp,包含polFN-a基因全部編碼序列;將克隆獲得的polFN-a基因插人哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pTARGET中,可成功構(gòu)建廣西巴馬小型豬重組表達(dá)載體pTAR-GET.polFN一0【。廣西巴馬dx型豬polFN-a與GenBankJ2已發(fā)表的豬、鼠、人刪.d基因同源性分別為97.o%、78.2%和66.3%;其成熟肽與普通豬相比,共有17個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變,其中第63、189、198、288、544、545位點(diǎn)為無義突變,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位點(diǎn)為錯(cuò)義突變?!窘Y(jié)論】IF
4、NLa成熟肽在哺乳動(dòng)物中保守性較差;克隆獲得的廣西巴馬小型豬polFN-a基因能成功插入哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pTARGETqb構(gòu)建重組表達(dá)載體pTAR—GET.polFN—ot,為研發(fā)重組豬干擾素類生物治療制劑、免疫佐劑、構(gòu)建小型豬疾病動(dòng)物模型等奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:廣西巴馬小型豬;刪一d基因;克??;真核表達(dá)載體;構(gòu)建中圖分類號(hào):$828.89文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):2095—1191(2013)09—1558—06Cloninginterferon-o【geneofGuangxiBamamini-pigandconstructingitseukaryoti
5、cexpressionvectorwuDanl”,LANGan—qiul,GUOYa—f色n1,CHENBao-jianl,CHENShao—meil,JIANGQin-yang1+(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2TeachingandExperimentCenterofBasicMedicineofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541002,China)Abstract:【Objectiv
6、e】AllcodedsequencesofBama—minipiginteferon—otgenewereclonedanditseukaryoticex—pressionvectorwasconstructedtoprovidereferencesforrestructuringswineinterferonimmunologicadiuvantandbiothera.PYpreparations.【Method]Apairofspecificprimersforporcineinterferon-alphal(polFN-a)wasdesignedan
7、dsynthesizedaccordingtogenesequence.a(chǎn)ndpolFN—olgenewasamplifiedbyRT—PCRfromperipheralsbloodlymphocytesofBama—minipig.ThenpolFN—aCDSwasclonedintopMDl8一Tvectorandsequenced.Moreover.po刪一olgenewithenzymesiteswasclonedintoeukaryoticexpressionvectorpTARGETtoconstructrecombinantexpressio
8、nplasnfidpTARGET—polFN—danditwast