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《PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)JournalofSouthernAgriculture2016，47(5)：726-730ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp：／／www．r血y)【b．cornDOI：10．39690：issn．2095-1191．2016．05．726PK一15細(xì)胞酵母雙雜交三框,eDNA文庫(kù)構(gòu)建及鑒定李殉，陳思宇，胡傳活，王曉曄’(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530005)摘要：【目的】構(gòu)建PK-15細(xì)胞酵母雙雜交三框eDNA文庫(kù)，為深入研究豬偽狂犬病病毒(PRv)與宿主細(xì)胞間的相互作用機(jī)制打下基礎(chǔ)6【方法】提Ii3LPK-15細(xì)胞
2、總RNA，采用SMART和LD．PcR合成全長(zhǎng)的雙鏈cDNA(dscDNA)，并對(duì)其進(jìn)行均一化和SfiI酶切處理。處理后的dscDNA分另II連接3種閱讀框pGADT7．Sfi威體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BH5a構(gòu)建三框eDNA初級(jí)文庫(kù)，取三框eDNA初級(jí)文庫(kù)進(jìn)行混合擴(kuò)增，通過(guò)滴度測(cè)定和PCR鑒定其庫(kù)容量和基因重組率，最后收集文庫(kù)細(xì)菌提取文庫(kù)質(zhì)粒?！窘Y(jié)果】3種讀碼框eDNA文庫(kù)的庫(kù)容量分別為3．0×106．2．OxlOe和2．0×106CFU，文庫(kù)實(shí)際擴(kuò)增基數(shù)>150萬(wàn)CFU；一號(hào)和三號(hào)讀碼框的基因重組率均為100％，二號(hào)讀碼框的基因重組率大于93％。eDN
3、A文庫(kù)外源基因插入片段長(zhǎng)度在500---3000bp。eDNA文庫(kù)質(zhì)粒濃度約1．0mg／mL，質(zhì)粒收獲量約3．0mg。【結(jié)論】構(gòu)建的PK．15細(xì)胞酵母雙雜交三框cDNAj(庫(kù)具有較高的重組率和庫(kù)容量，符合酵母雙雜交篩選要求，可用于研究PRV與PK．15細(xì)胞問(wèn)的相互作用機(jī)制。關(guān)鍵詞：PK．15細(xì)胞；酵母雙雜交；三框cDNA文庫(kù)；均一化；豬偽狂犬病病毒(PRV)中圖分類(lèi)號(hào)：S852．65文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095—1191(2016)05—0726—05U0nStrUcttonandldentlnCatlonJ11』·‘1●1■●mJ●cDNAlibrary
4、ofyeasttwo—hybridthree-frameofPK-15cellsLIXun，CHENSi—yu，HUChuan-huo，WANGXiao—ye+(CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)Abstract：【Objective】Yeasttwo—hybridthree—frameeDNAlibraryofPK一15cellswasconstructed，inordertolaythefoundationforinvestigatingint
5、eractionmechanismbetweenpseudorabiesvirus(PRV)anditshostcells．【MethodlTotalRNAwasextractedfromPK一15cells，andt}lefull—lengthdouble—strandeDNA(dseDNA)WassynthesizedusingSMARTandLD—pCR。whichwasligatedtothree—frameexpressionvectorpGADT7一S／7IafternomalizationandS療Idigestion．respectively．
6、TheligationproductwastransformedintoEscheffchiacolitoconstructprimarythree—frameexpressioneDNAlibrary．ThreeprimarycDNAlibrariesweremixedandamplified．Thecapacityandrecombinationrateoflibrarywerede．terminedbytitertestandPCRidentification．Finally，allbacteriawerecollectedtoextractlibrar
7、yplasmid．【Result】r11lecapacitiesofthreereadingframelibrarieswere3．0×106．2．0×106and2．0×106CFU．respectively．Thepracticalamplifica—tionbaseoflibrary．wasmorethan1．5millionCFU．Therecombinationratesofthreeflamelibrarieswere100％．morethan93％and100％．respectively．’nleinsertedfragmentofexogeno
8、usgenewas500-3000bp
