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1、抗多肽制備流程及原理11/11/81.抗原多肽的設計2.抗原多肽的偶聯(lián)策略3.多肽合成簡介4.抗多肽血清的制備5.血清的檢測1.抗原多肽的設計為產生有效的抗體，第一步是設計好的抗原，此抗原可以來源于整個蛋白質的一部分：一個或幾抗原決定簇區(qū)域的序列。（1）什么是抗原決定簇？蛋白質表面部分可以使免疫系統(tǒng)產生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6－12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質一級結構）組成或由不連續(xù)的蛋白質三維結構組成。（2）選擇抗原決定簇為選擇好的抗原決定簇，應符合以下三點：1．親水性(Hydrophilicity)：大部分抗原決定
2、簇是親水性的；2．表面可接觸性(SurfaceAccessibility)：大部分抗體只與蛋白質表面部分結合；3．有彈性(flexibility)：許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。（3）抗原性與免疫原性單獨的抗原決定簇是不能產生免疫反應，它只有抗原性但沒有免疫原性，為使它能具有免疫原性，它必須偶聯(lián)在載體蛋白上。（4）抗原決定簇的預測對每個氨基酸的表面可接觸性、親水性和彈性進行計算可以大體推算出抗原決定簇區(qū)域，抗原決定簇區(qū)域應綜合以上三個特點。目前市面上有幾個專業(yè)測定軟件滿足需要：如MacVestor
3、,Protean,GCG等。備注（5）設計多肽序列的長度抗原性區(qū)域確定以后，接下來要確定多肽的長度。關于選定多肽長度有兩種不同的觀點。一種觀點認為長的多肽（20－40個氨基酸）比較好，因為長的多肽無疑會增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點則認為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產生抗體的位點特異性。但有一點是明確的，不管長度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反應的影響較大，高于二十個氨基酸的多肽通常很難進行高純度合成，并且常常會含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽（<10個氨基酸）則會產生識別特異性
4、很強的抗體，以至于無法識別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般是10－20個氨基。這種長度的多肽序列會最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會具有一定程度的二級結構。（6）設計合成多肽一旦抗原序列決定后，接下來就是設計所需合成的多肽了，設計時除了注意其序列外，同時應考慮一些產生免疫機制問題，如：1．載體蛋白的接入位置。2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基團，而N端被掩蓋。同時如果載體蛋白是通過半胱氨酸偶聯(lián)，此半胱氨酸應處于N端位置，使C端完全暴露給免疫系統(tǒng)。3．相反，如果其序列是位于蛋白質N端，此多
5、肽C端應掩蓋，暴露出N端，而載體蛋白應在C端。2.抗原多肽的耦聯(lián)策略化學合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產生很弱的免疫反應，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T細胞，進而誘導B細胞反應。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲狀腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)
6、載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產的抗體在應用上存在著一定的局限性。設計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如，N-端序列需要通過C-端氨基酸耦聯(lián)，而C-端序列則需要通過N-端氨基酸耦聯(lián)。內部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內部序列耦聯(lián)的另一考量則是將非共軛端酰基化或氨基化，因為原蛋白分子序列中不會含有帶電荷的末端。最常用的耦聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集團(Asp,Glu,或alpha-羧基)的存在。所有的耦聯(lián)方法都應該是通過羧
7、基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯(lián)化學反應。如果多個反應位點存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應位點都位于一端的多肽。對于內部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行耦聯(lián)，這樣可以避免可能的屏蔽問題。除非研究人員另做說明，我們通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)或carbodiimide方法將多肽和載體進行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側鏈羧基集團及末端羧基集團，使之與主胺基發(fā)生
8、耦聯(lián)反應。激活的多肽與載體蛋白混合而產生最終的共軛體
