抗多肽制備流程及原理.ppt

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1、抗多肽制備流程及原理11/11/81.抗原多肽的設(shè)計2.抗原多肽的偶聯(lián)策略3.多肽合成簡介4.抗多肽血清的制備5.血清的檢測1.抗原多肽的設(shè)計為產(chǎn)生有效的抗體，第一步是設(shè)計好的抗原，此抗原可以來源于整個蛋白質(zhì)的一部分：一個或幾抗原決定簇區(qū)域的序列。（1）什么是抗原決定簇？蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6－12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。（2）選擇抗原決定簇為選擇好的抗原決定簇，應(yīng)符合以下三點：1．親水性(Hydrophilicity)：大部分抗原決定

2、簇是親水性的；2．表面可接觸性(SurfaceAccessibility)：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合；3．有彈性(flexibility)：許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。（3）抗原性與免疫原性單獨的抗原決定簇是不能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，它只有抗原性但沒有免疫原性，為使它能具有免疫原性，它必須偶聯(lián)在載體蛋白上。（4）抗原決定簇的預(yù)測對每個氨基酸的表面可接觸性、親水性和彈性進行計算可以大體推算出抗原決定簇區(qū)域，抗原決定簇區(qū)域應(yīng)綜合以上三個特點。目前市面上有幾個專業(yè)測定軟件滿足需要：如MacVestor

3、,Protean,GCG等。備注（5）設(shè)計多肽序列的長度抗原性區(qū)域確定以后，接下來要確定多肽的長度。關(guān)于選定多肽長度有兩種不同的觀點。一種觀點認(rèn)為長的多肽（20－40個氨基酸）比較好，因為長的多肽無疑會增加抗原基的數(shù)量。另一種觀點則認(rèn)為小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所產(chǎn)生抗體的位點特異性。但有一點是明確的，不管長度如何，所選多肽必須能夠較容易地通過生化合成得到，并且能溶解到水溶性緩沖劑進行載體蛋白的耦聯(lián)。由于受副反應(yīng)的影響較大，高于二十個氨基酸的多肽通常很難進行高純度合成，并且常常會含有缺失性序列。另一方面，太短的多肽（<10個氨基酸）則會產(chǎn)生識別特異性

4、很強的抗體，以至于無法識別整體蛋白，或親和性很低。因此綜合考慮制備性抗原地多肽有效長度一般是10－20個氨基。這種長度的多肽序列會最大程度的減小生化合成困難，具有一定的水溶性，也會具有一定程度的二級結(jié)構(gòu)。（6）設(shè)計合成多肽一旦抗原序列決定后，接下來就是設(shè)計所需合成的多肽了，設(shè)計時除了注意其序列外，同時應(yīng)考慮一些產(chǎn)生免疫機制問題，如：1．載體蛋白的接入位置。2．如果其序列是位于蛋白C端的，此多肽C端一定是自由的羧基團，而N端被掩蓋。同時如果載體蛋白是通過半胱氨酸偶聯(lián)，此半胱氨酸應(yīng)處于N端位置，使C端完全暴露給免疫系統(tǒng)。3．相反，如果其序列是位于蛋白質(zhì)N端，此多

5、肽C端應(yīng)掩蓋，暴露出N端，而載體蛋白應(yīng)在C端。2.抗原多肽的耦聯(lián)策略化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T細(xì)胞，進而誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)。用于與多肽耦聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最常用的是(keyholelimpethemacyanin(KLH),牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲狀腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最為常用的多肽耦聯(lián)

6、載體。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。設(shè)計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。例如，N-端序列需要通過C-端氨基酸耦聯(lián)，而C-端序列則需要通過N-端氨基酸耦聯(lián)。內(nèi)部序列則可以耦聯(lián)到任何一端。內(nèi)部序列耦聯(lián)的另一考量則是將非共軛端?；虬被驗樵鞍追肿有蛄兄胁粫袔щ姾傻哪┒?。最常用的耦聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集團(Asp,Glu,或alpha-羧基)的存在。所有的耦聯(lián)方法都應(yīng)該是通過羧

7、基或氨基端殘基將多肽耦聯(lián)到載體蛋白上。所選序列不能有多個殘基都能參與所選耦聯(lián)化學(xué)反應(yīng)。如果多個反應(yīng)位點存在，可以考慮將多肽序列縮短，或者選擇所有反應(yīng)位點都位于一端的多肽。對于內(nèi)部序列通常會使用離所預(yù)測抗原位點較遠(yuǎn)的一端進行耦聯(lián)，這樣可以避免可能的屏蔽問題。除非研究人員另做說明，我們通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)或carbodiimide方法將多肽和載體進行耦聯(lián)。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的側(cè)鏈羧基集團及末端羧基集團，使之與主胺基發(fā)生

8、耦聯(lián)反應(yīng)。激活的多肽與載體蛋白混合而產(chǎn)生最終的共軛體