植物基因轉(zhuǎn)化常用方法植物遺傳,農(nóng)桿菌、病毒介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化法.doc

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1、一.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法　　植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。二.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法（一）農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機(jī)制　　幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefa

2、ciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。農(nóng)桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulenceregion)基因的啟動表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈T－DNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合

3、成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農(nóng)桿菌生長必需的物質(zhì)?！　?.Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)　　在發(fā)現(xiàn)根瘤農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤的本質(zhì)是Ti質(zhì)粒后，Ti質(zhì)粒便成為冠癭瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對象。　　Ti質(zhì)粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（regionencodingconjugation)和Ori區(qū)（ori

4、ginofreplication)。T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義?！　　ms由兩個基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）　　　tmr由一個基因組成iptz：　　　tmt由若干基因構(gòu)成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個成員：　　　octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物　　　Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物　　　Agropine＝谷氨酸與二環(huán)糖的縮合物　　　據(jù)此可將Ti質(zhì)粒分為三大類，感

5、染的植物誘導(dǎo)合成這些有機(jī)堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌使用作為氮源及碳源。