植物基因轉(zhuǎn)化常用方法植物遺傳,農(nóng)桿菌、病毒介導(dǎo)和基因槍轉(zhuǎn)化法.doc

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1、一.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法　　植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。二.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法（一）農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機(jī)制　　幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefa

2、ciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。農(nóng)桿根瘤菌之所以會(huì)感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulenceregion)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈T－DNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合

3、成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農(nóng)桿菌生長必需的物質(zhì)。　　1.Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)　　在發(fā)現(xiàn)根瘤農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤的本質(zhì)是Ti質(zhì)粒后，Ti質(zhì)粒便成為冠癭瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對(duì)象?！　i質(zhì)粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（regionencodingconjugation)和Ori區(qū)（ori

4、ginofreplication)。T-DNA上共有三套基因和左右兩個(gè)邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。　　　tms由兩個(gè)基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）　　　tmr由一個(gè)基因組成iptz：　　　tmt由若干基因構(gòu)成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個(gè)成員：　　　octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物　　　Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物　　　Agropine＝谷氨酸與二環(huán)糖的縮合物　　　據(jù)此可將Ti質(zhì)粒分為三大類，感

5、染的植物誘導(dǎo)合成這些有機(jī)堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌使用作為氮源及碳源。