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《樹(shù)鼩呼腸孤病毒RT-nPCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、2014年6月中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志June，2014第24卷第6期CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEV0l_24NO．6樹(shù)胸呼腸孤病毒RT—nPCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用李曉飛，殷安國(guó)，張媛，羅軍，孫曉梅，代解杰(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹(shù)嗣種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650118)【摘要】目的建立樹(shù)嗣呼腸孤病毒(TRV)RT．nPCR檢測(cè)方法，為樹(shù)購(gòu)的質(zhì)量控制提供檢測(cè)方法。方法從三批野外來(lái)源的具有感染臨床癥狀的樹(shù)鼠句糞便中分離得到三株病毒，經(jīng)電鏡觀察和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為哺乳動(dòng)物呼腸孤
2、病毒(MRV)。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的MRVL1基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)合成巢式引物，對(duì)所分離的三株樹(shù)鼢呼腸孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA進(jìn)行RT—nPCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性、敏感性試驗(yàn)。應(yīng)用RT-nPCR方法對(duì)25只野外來(lái)源的相同癥狀疑似病例樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果針對(duì)分離到的三株樹(shù)胸呼腸孤病毒的RNA進(jìn)行RT—nPCR擴(kuò)增，均得到513bp的特異性目的片段，培養(yǎng)細(xì)胞及甲肝病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示可檢測(cè)到的最小RNA模板濃度為0．O1pg／L。25只樹(shù)嗣糞便樣本經(jīng)RT-nPCR檢測(cè)，有14只TRV陽(yáng)
3、性，其中死亡動(dòng)物組1O只，檢出率為100％；存活動(dòng)物組l5只，檢出率為27％。結(jié)論建立的TRVRT—nPCR檢測(cè)方法特異、敏感、穩(wěn)定，可用于TRV的常規(guī)檢測(cè)。【關(guān)鍵詞】樹(shù)嗣；哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒；反轉(zhuǎn)錄巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；巢式引物【中圖分類(lèi)號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1671—7856(2014)06—0063—06doi：10．3969．j．issn．1671．7856．2014．006．014一EstablishmentandapplicationofaRT-nPCRassayfor，c技detection0f0rth0reOvirusintreeshrew
4、s術(shù)Ic方法LIXiao—fei，YINAn—guo，ZHANGYuan，LUOJun，SUNXiao—mei，DAIJie—jie(CenterofTreeShrewsGermplasmResources，InstituteofMedicalBiology，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege．YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentOnSevereInfectionDiseases，Kunming650118，China)【Abs
5、tract】ObjectiveToestablishareversetranscriptionnestedpolymerasechainreaction(RT—nPCR)assayfordetectionoftreeshrewsorthoreovirus(TRV)．MethodsThreestrainsofTRVwererespectivelyisolatedfromfreshfecesofthreetreeshrewsthatcamefromthesamefieldatdifferenttimes．WedesignedandsynthesizedtwopairsofM
6、RVL1genenestedprimersandestablishedthesystemofRT—nPCR．TheTRVRNAwasextractedandreverselytranscribedtocDNAasatemplatefornested—PCRamplification．ThedevelopedRT—nPCRwasoptimized．Thespecificityandsensitivityweretested．Finally，theRT—nPCRwasusedtodetectTRVin25treeshrewsamples．ResultsTakingthege
7、nomicRNAofTRVastemplate，theRT—nPCRwasabletoamplifyaspecificfragmentbandtargetingtheL1gene，whiletherewereno[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAII5B01—21；20l2BAI39B0l；2014BA101B01)，云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)(2013DA002)[作者簡(jiǎn)介]李曉飛(1988一)，女，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。[通訊作者]孫曉梅(1963一)，女，主任技師，E-mail：sxm@imbcams．com．cn；代
