資源描述：
《樹鼩呼腸孤病毒RT-nPCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、2014年6月中國比較醫(yī)學(xué)雜志June，2014第24卷第6期CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEV0l_24NO．6樹胸呼腸孤病毒RT—nPCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用李曉飛，殷安國，張媛，羅軍，孫曉梅，代解杰(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹嗣種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明650118)【摘要】目的建立樹嗣呼腸孤病毒(TRV)RT．nPCR檢測方法，為樹購的質(zhì)量控制提供檢測方法。方法從三批野外來源的具有感染臨床癥狀的樹鼠句糞便中分離得到三株病毒，經(jīng)電鏡觀察和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為哺乳動物呼腸孤
2、病毒(MRV)。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的MRVL1基因的保守區(qū)域，設(shè)計合成巢式引物，對所分離的三株樹鼢呼腸孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA進(jìn)行RT—nPCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性、敏感性試驗。應(yīng)用RT-nPCR方法對25只野外來源的相同癥狀疑似病例樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果針對分離到的三株樹胸呼腸孤病毒的RNA進(jìn)行RT—nPCR擴(kuò)增，均得到513bp的特異性目的片段，培養(yǎng)細(xì)胞及甲肝病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒陰性對照均未擴(kuò)增出條帶。敏感性試驗結(jié)果顯示可檢測到的最小RNA模板濃度為0．O1pg／L。25只樹嗣糞便樣本經(jīng)RT-nPCR檢測，有14只TRV陽
3、性，其中死亡動物組1O只，檢出率為100％；存活動物組l5只，檢出率為27％。結(jié)論建立的TRVRT—nPCR檢測方法特異、敏感、穩(wěn)定，可用于TRV的常規(guī)檢測。【關(guān)鍵詞】樹嗣；哺乳動物呼腸孤病毒；反轉(zhuǎn)錄巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；巢式引物【中圖分類號】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1671—7856(2014)06—0063—06doi：10．3969．j．issn．1671．7856．2014．006．014一EstablishmentandapplicationofaRT-nPCRassayfor，c技detection0f0rth0reOvirusintreeshrew
4、s術(shù)Ic方法LIXiao—fei，YINAn—guo，ZHANGYuan，LUOJun，SUNXiao—mei，DAIJie—jie(CenterofTreeShrewsGermplasmResources，InstituteofMedicalBiology，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege．YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentOnSevereInfectionDiseases，Kunming650118，China)【Abs
5、tract】ObjectiveToestablishareversetranscriptionnestedpolymerasechainreaction(RT—nPCR)assayfordetectionoftreeshrewsorthoreovirus(TRV)．MethodsThreestrainsofTRVwererespectivelyisolatedfromfreshfecesofthreetreeshrewsthatcamefromthesamefieldatdifferenttimes．WedesignedandsynthesizedtwopairsofM
6、RVL1genenestedprimersandestablishedthesystemofRT—nPCR．TheTRVRNAwasextractedandreverselytranscribedtocDNAasatemplatefornested—PCRamplification．ThedevelopedRT—nPCRwasoptimized．Thespecificityandsensitivityweretested．Finally，theRT—nPCRwasusedtodetectTRVin25treeshrewsamples．ResultsTakingthege
7、nomicRNAofTRVastemplate，theRT—nPCRwasabletoamplifyaspecificfragmentbandtargetingtheL1gene，whiletherewereno[基金項目]國家科技支撐計劃(2011BAII5B01—21；20l2BAI39B0l；2014BA101B01)，云南省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)(2013DA002)[作者簡介]李曉飛(1988一)，女，碩士，研究方向：實驗動物病毒學(xué)。[通訊作者]孫曉梅(1963一)，女，主任技師，E-mail：sxm@imbcams．com．cn；代
