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《丙型肝炎病毒核酸HCV-RNA擴增熒光定量檢測標準操作sop.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、單位及實驗室名稱項目編號：日期：版本：丙型肝炎病毒核酸HCV-RNA擴增熒光定量檢測標準操作程序1.目的：明確丙肝病毒核酸定量檢測的操作規(guī)程，指導檢驗人員正確進行丙肝病毒核酸定量的檢測。2.適用范圍：2.1適用于進行丙肝病毒核酸定量檢測的檢驗人員。2.2適合儀器：LightCycler480型核酸擴增熒光檢測儀2.3方法原理：采用PCR方法結(jié)合熒光探針的擴增技術(shù)2.4樣品要求：血清3.職責：實驗操作人員應嚴格按操作規(guī)程進行實驗。4.試劑來源：深圳凱杰公司HCVRNA熒光PCR檢測試劑盒。5.質(zhì)控物
2、：陰性、陽性對照及陽性參控品系列均來源于試劑盒6.標準操作：6.1試劑準備（在試劑準備區(qū)操作）6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍，完全融解后混勻。6.1.2根據(jù)當次實驗標本量，取出相應試劑（1管=28ul反應液+2ulEnzymeMix）總的需求量于一管中（其余隨即放回原溫度保存），如所需要的管數(shù)為n(n=標本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照+1管臨界陽性對照+4管陽性參控品)（定性檢測無需做陽性參控品），取PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本制備區(qū)。6.2.實驗前準備步驟：6.2.1所需試劑置室溫平衡，
3、裂解液和洗液1如出絮狀沉淀，37℃溫浴至沉淀完全消失。6.2.2在洗液1中加入16ml無水乙醇，做好標記,室溫保存,使用前搖勻。6.2.3在洗液2中加入23ml無水乙醇，做好標記,室溫保存,使用前搖勻。6.2.4將310ul的洗脫液加入含有310ug的CarrierRNA中,充分混勻,分裝,-20℃儲存.不要反復凍融3次.6.2.5裂解液工作液的制備混合后2-8℃穩(wěn)定保存48小時,裂解液工作液必須每次實驗前新鮮配制ASJYK-LAB-C-P-46第2頁，共4頁裂解液工作液制備表人份數(shù)裂解液用量(m
4、l)CarrierRNA混合液用量(ul)HCV內(nèi)對照用量(ul)人份數(shù)裂解液用量(ml)CarrierRNA混合液用量(ul)HCV內(nèi)對照用量(ul)10.226.26.6132.8680.185.820.4412.313.2143.0886.392.430.6618.519.8153.3092.49940.8824.626.4163.5298.6105.651.1030.833173.74104.7112.261.3237.039.6183.96110.9118.871.5443.146.21
5、94.18117.0125.481.7649.352.8204.40123.213291.9855.459.4214.62129.4138.6102.2061.666224.84135.5145.2112.4267.872.6235.06141.7151.8122.6473.979.2245.28147.8158.46.2.6將1.4ml蛋白酶溶解液加入蛋白酶凍干粉試劑瓶中,混勻至完全溶解,避免有泡沫,2-8℃保存.6.3樣本制備及加樣（在標本制備區(qū)操作）6.2.1取n個1.5ml的滅菌離心管（n
6、=樣本數(shù)＋1管陰性對照+1管強陽性對照＋1管臨界陽性對照），做好標記。6.2.2分別加入25ul蛋白酶溶液.6.2.3分別加入待測樣本,陰性對照,強陽性對照,臨界陽性對照各200ul6.2.4加200ul新鮮配制的裂解液工作液蓋上蓋子,振蕩15秒,混勻(不可把蛋白酶溶液加入到裂解液中).6.2.556℃溫浴15min,瞬時離心,去除蓋上液滴.6.2.6加入250ul無水乙醇,蓋上蓋子,振蕩15s,室溫靜置5min.,瞬時離心,去除蓋上液滴.(室溫超過25℃,無水乙醇要預冷.)6.2.7將n個純化柱
7、放入收集管中,將6.2.7的液體移入到純化柱中,蓋上蓋子,6000g離心1min,倒掉廢液.6.2.8打開純化柱的蓋子,加入500ul洗液1,6000g離心1min,倒掉廢液.6.2.9打開純化柱的蓋子,加入500ul洗液2,6000g離心1min,倒掉廢液.6.2.10打開純化柱的蓋子,加入500ul無水乙醇,6000g離心1min,倒掉廢液.將純化柱放入新的收集管中.6.2.1120000g高速離心3min,除去乙醇.ASJYK-LAB-C-P-46第3頁，共4頁6.2.12將純化柱放入干凈的
8、1.5ml離心管中,開蓋,56℃溫浴3min,以除去殘留液體.6.2.13將純化柱放入另一個干凈1.5ml離心管中,加入60ul洗脫液(加到膜中央).蓋上蓋子,室溫靜置5min.20000g離心1min收集濾出液.4℃保存?zhèn)溆?應在2h內(nèi)用于PCR擴增,或-70℃保存一個月6.2.14取20ul的6.2.13的RNA溶液及定量標準品,加入PCR反應管中.6.3PCR擴增（在擴增區(qū)操作）6.3.1打開穩(wěn)壓器電源，再打開計算機電源。6.3.2打開擴增儀電源，按儀器操作規(guī)程進入擴增循環(huán)條
