細(xì)菌藥敏試驗(yàn).doc

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1、實(shí)訓(xùn)細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)使學(xué)生掌握細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)的操作方法，能夠利用本試驗(yàn)方法選擇敏感藥物治療獸醫(yī)臨床常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染病。材料準(zhǔn)備1．器材：溫箱、天平、打孔機(jī)、濾紙、無(wú)菌試管及吸管、鑷子、接種環(huán)、酒精燈等。2．試劑：蒸餾水。3．培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。4．菌種：金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的固體培養(yǎng)物。5．藥品：鏈霉素、金霉素、新霉素、紅霉素等抗菌藥物。6．硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管：取1%~1.5%氯化鋇0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混勻即成，用前充分振蕩。方法步驟將抗菌藥物置于接種待檢菌的固體

2、培養(yǎng)基上，抗菌藥物通過(guò)向培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散，抑制敏感細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)。由于藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，達(dá)到該距離的藥物濃度越低，由此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度。（一）含藥紙片的制備1．濾紙片最好選用新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成直徑6mm的濾紙片，放在小瓶中或平皿中，在121.3℃滅菌15min，再置100℃干燥箱內(nèi)烘干備用。2．藥液的配制用無(wú)菌蒸餾水將各藥稀釋成以下濃度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、鏈霉素、金霉素、新霉素、紅霉素、多粘菌素1000μg/ml。3．含藥紙

3、片的制備將滅菌的濾紙片用無(wú)菌的鑷子攤布于滅菌平皿中，按每張濾紙片飽和吸水量為0.01ml計(jì)算，50張濾紙片加入藥液0.5ml。要不時(shí)翻動(dòng)，使紙片充分吸收藥液，浸泡1~2h后于37℃溫箱中烘干備用。對(duì)青霉素、金霉素紙片的干燥宜采用低溫真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干燥器內(nèi)或置-20℃冰箱中保存。紙片的有效期一般為4~6個(gè)月。（二）測(cè)驗(yàn)方法1．鉤取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落各4~5個(gè)，分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4~6h。2．用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)菌液，使其濁度相當(dāng)于硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管。裝有以上

4、兩種成分的試管須相同，硫酸鋇應(yīng)用前需充分振動(dòng)。3．用無(wú)菌棉拭子蘸取上述肉湯培養(yǎng)液，在試管壁上擠壓除去多余的液體，在瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂抹。每種細(xì)菌分別接種1~2個(gè)瓊脂平板。4．用玻璃鉛筆在平皿底部標(biāo)記藥物名稱。一個(gè)直徑9cm的平皿最多只能貼7張紙片，6張均勻的貼在距平皿邊緣15mm處，一張位于中心。5．用滅菌鑷子夾取干燥含藥紙片，按標(biāo)記位置輕貼在已接種細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，一次放好，不得移動(dòng)。6．37℃溫箱中培養(yǎng)16~18h，觀察、記錄并分析結(jié)果。根據(jù)抑菌環(huán)直徑的大小按實(shí)表2標(biāo)準(zhǔn)判定各種藥物的敏感度。

5、實(shí)表1細(xì)菌對(duì)不同抗菌藥物敏感度標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物每片含藥量（μ）抑菌環(huán)直徑（mm）不敏感中度敏感高度敏感青霉素葡萄球菌其它細(xì)菌鏈霉素金霉素新霉素紅霉素卡那霉素慶大霉素多粘菌素萬(wàn)古霉素磺胺嘧啶環(huán)丙沙星諾氟沙星利福平1010101030153010300302505105≤20≤11≤11≤10≤12≤13≤13≤12≤8≤9≤12≤15≤12≤1621~2812~2112~141013~1614~2214~1713~149~1110~1113~1616~2013~1617~19≥29≥22≥15≥10≥17≥

6、23≥18≥15≥12≥12≥17≥21≥17≥20對(duì)于復(fù)方藥物可通過(guò)比較各藥物抑菌環(huán)直徑的大小，在試驗(yàn)用藥中選出最敏感的藥物。注意事項(xiàng)1．接種菌液的濃度必須標(biāo)準(zhǔn)化，一般以細(xì)菌在瓊脂平板上生長(zhǎng)一定時(shí)間后呈融合狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)。如菌液濃度過(guò)大，會(huì)使抑菌環(huán)減小；濃度過(guò)小，會(huì)使抑菌環(huán)增大。2．接種后應(yīng)及時(shí)貼上含藥紙片并放入37℃溫箱中培養(yǎng)。3．培養(yǎng)時(shí)間一般為16~18h，結(jié)果判定不宜過(guò)早，但培養(yǎng)過(guò)久，細(xì)菌可能恢復(fù)生長(zhǎng)，使抑菌環(huán)縮小。4．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止污染抗生素，否則可發(fā)生抑菌環(huán)縮小或無(wú)抑菌環(huán)現(xiàn)象5．因蛋白胨可使

7、磺胺失去作用，故磺胺類藥物應(yīng)采用無(wú)胨瓊脂。附：無(wú)胨瓊脂的配制方法牛肉膏或酵母浸膏5.0g氯化鈉5.0g瓊脂25g水1000ml將牛肉膏或酵母浸膏、氯化鈉和水混合后加熱溶解，測(cè)定并矯正PH為7.2~7.4，過(guò)濾后加入瓊脂，煮沸使瓊脂充分溶化，121.3℃高壓蒸氣滅菌15min，分裝平皿，靜置冷卻即成瓊脂平板。第一天：操作程序：1、制備含藥紙片：（1）打孔機(jī)打出定量（20、30或50片）紙片，置于平皿內(nèi)。（2）紙片高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌，121.3℃高壓蒸氣滅菌15min。（3）滅菌后紙片置于100℃干燥箱

8、內(nèi)烘干。2、培養(yǎng)基準(zhǔn)備（1）營(yíng)養(yǎng)瓊脂：①稱取4.5克營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉，加水100ML，微波爐中溶解后，置于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌121.3℃高壓蒸氣滅菌15min。②滅菌后取出，倒板（倒入直徑90ｍｍ滅菌平皿內(nèi)，厚度2－3ｍｍ），室溫下靜止，凝固后備用。（2）營(yíng)養(yǎng)肉湯①稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯粉定量，加水，微波爐中溶解，調(diào)節(jié)PH至7.2－7.6，分裝試管（裝量為試管高度1／3）高壓蒸汽滅菌。（以上操作中三處高壓蒸汽滅菌可放一起完成）3、菌種準(zhǔn)備（1）金黃色葡萄球菌：（2）大