細(xì)菌藥敏試驗.doc

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1、實訓(xùn)細(xì)菌的藥物敏感性試驗教學(xué)目標(biāo)使學(xué)生掌握細(xì)菌藥物敏感性試驗的操作方法，能夠利用本試驗方法選擇敏感藥物治療獸醫(yī)臨床常見的細(xì)菌性傳染病。材料準(zhǔn)備1．器材：溫箱、天平、打孔機(jī)、濾紙、無菌試管及吸管、鑷子、接種環(huán)、酒精燈等。2．試劑：蒸餾水。3．培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。4．菌種：金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的固體培養(yǎng)物。5．藥品：鏈霉素、金霉素、新霉素、紅霉素等抗菌藥物。6．硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管：取1%~1.5%氯化鋇0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混勻即成，用前充分振蕩。方法步驟將抗菌藥物置于接種待檢菌的固體

2、培養(yǎng)基上，抗菌藥物通過向培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散，抑制敏感細(xì)菌的生長，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)。由于藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，達(dá)到該距離的藥物濃度越低，由此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定細(xì)菌對藥物的敏感度。（一）含藥紙片的制備1．濾紙片最好選用新華1號定性濾紙，用打孔機(jī)打成直徑6mm的濾紙片，放在小瓶中或平皿中，在121.3℃滅菌15min，再置100℃干燥箱內(nèi)烘干備用。2．藥液的配制用無菌蒸餾水將各藥稀釋成以下濃度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、鏈霉素、金霉素、新霉素、紅霉素、多粘菌素1000μg/ml。3．含藥紙

3、片的制備將滅菌的濾紙片用無菌的鑷子攤布于滅菌平皿中，按每張濾紙片飽和吸水量為0.01ml計算，50張濾紙片加入藥液0.5ml。要不時翻動，使紙片充分吸收藥液，浸泡1~2h后于37℃溫箱中烘干備用。對青霉素、金霉素紙片的干燥宜采用低溫真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干燥器內(nèi)或置-20℃冰箱中保存。紙片的有效期一般為4~6個月。（二）測驗方法1．鉤取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落各4~5個，分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4~6h。2．用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)菌液，使其濁度相當(dāng)于硫酸鋇標(biāo)準(zhǔn)管。裝有以上

4、兩種成分的試管須相同，硫酸鋇應(yīng)用前需充分振動。3．用無菌棉拭子蘸取上述肉湯培養(yǎng)液，在試管壁上擠壓除去多余的液體，在瓊脂培養(yǎng)基表面均勻涂抹。每種細(xì)菌分別接種1~2個瓊脂平板。4．用玻璃鉛筆在平皿底部標(biāo)記藥物名稱。一個直徑9cm的平皿最多只能貼7張紙片，6張均勻的貼在距平皿邊緣15mm處，一張位于中心。5．用滅菌鑷子夾取干燥含藥紙片，按標(biāo)記位置輕貼在已接種細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，一次放好，不得移動。6．37℃溫箱中培養(yǎng)16~18h，觀察、記錄并分析結(jié)果。根據(jù)抑菌環(huán)直徑的大小按實表2標(biāo)準(zhǔn)判定各種藥物的敏感度。

5、實表1細(xì)菌對不同抗菌藥物敏感度標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物每片含藥量（μ）抑菌環(huán)直徑（mm）不敏感中度敏感高度敏感青霉素葡萄球菌其它細(xì)菌鏈霉素金霉素新霉素紅霉素卡那霉素慶大霉素多粘菌素萬古霉素磺胺嘧啶環(huán)丙沙星諾氟沙星利福平1010101030153010300302505105≤20≤11≤11≤10≤12≤13≤13≤12≤8≤9≤12≤15≤12≤1621~2812~2112~141013~1614~2214~1713~149~1110~1113~1616~2013~1617~19≥29≥22≥15≥10≥17≥

6、23≥18≥15≥12≥12≥17≥21≥17≥20對于復(fù)方藥物可通過比較各藥物抑菌環(huán)直徑的大小，在試驗用藥中選出最敏感的藥物。注意事項1．接種菌液的濃度必須標(biāo)準(zhǔn)化，一般以細(xì)菌在瓊脂平板上生長一定時間后呈融合狀態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)。如菌液濃度過大，會使抑菌環(huán)減??；濃度過小，會使抑菌環(huán)增大。2．接種后應(yīng)及時貼上含藥紙片并放入37℃溫箱中培養(yǎng)。3．培養(yǎng)時間一般為16~18h，結(jié)果判定不宜過早，但培養(yǎng)過久，細(xì)菌可能恢復(fù)生長，使抑菌環(huán)縮小。4．實驗過程中要防止污染抗生素，否則可發(fā)生抑菌環(huán)縮小或無抑菌環(huán)現(xiàn)象5．因蛋白胨可使

7、磺胺失去作用，故磺胺類藥物應(yīng)采用無胨瓊脂。附：無胨瓊脂的配制方法牛肉膏或酵母浸膏5.0g氯化鈉5.0g瓊脂25g水1000ml將牛肉膏或酵母浸膏、氯化鈉和水混合后加熱溶解，測定并矯正PH為7.2~7.4，過濾后加入瓊脂，煮沸使瓊脂充分溶化，121.3℃高壓蒸氣滅菌15min，分裝平皿，靜置冷卻即成瓊脂平板。第一天：操作程序：1、制備含藥紙片：（1）打孔機(jī)打出定量（20、30或50片）紙片，置于平皿內(nèi)。（2）紙片高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌，121.3℃高壓蒸氣滅菌15min。（3）滅菌后紙片置于100℃干燥箱

8、內(nèi)烘干。2、培養(yǎng)基準(zhǔn)備（1）營養(yǎng)瓊脂：①稱取4.5克營養(yǎng)瓊脂粉，加水100ML，微波爐中溶解后，置于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)滅菌121.3℃高壓蒸氣滅菌15min。②滅菌后取出，倒板（倒入直徑90ｍｍ滅菌平皿內(nèi)，厚度2－3ｍｍ），室溫下靜止，凝固后備用。（2）營養(yǎng)肉湯①稱取營養(yǎng)肉湯粉定量，加水，微波爐中溶解，調(diào)節(jié)PH至7.2－7.6，分裝試管（裝量為試管高度1／3）高壓蒸汽滅菌。（以上操作中三處高壓蒸汽滅菌可放一起完成）3、菌種準(zhǔn)備（1）金黃色葡萄球菌：（2）大