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《胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆表達及免疫原性研究.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆、表達及免疫原性研究研究生：富亮指導教師：趙玉軍教授徐福洲博士專業(yè)名稱：預防獸醫(yī)學研究方向：動物傳染病學所在學院：畜牧獸醫(yī)學院胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆、表達及免疫原性研究第一章前言第二章apxⅠA基因的克隆與原核表達第三章apxⅠA表達蛋白的免疫原性研究豬傳染性胸膜肺炎概況豬傳染性胸膜肺炎（Porcinecontagiouspleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）引起的豬的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺臟廣泛的纖維素性滲出、壞死、
2、出血、胸膜粘連，中性細胞、淋巴細胞以及巨噬細胞的浸潤，血管栓塞，纖維素沉積等。各種年齡豬對該病均易感，新疫區(qū)常急性爆發(fā)，急性感染尤其是24～25日齡仔豬感染后表現(xiàn)出極高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病仔豬迅速死亡，死亡率達到20％以上，最急性型可達80％～100％，并且長期帶菌而成為傳染性胸膜肺炎再次爆發(fā)和流行的潛在傳染源，給本病的控制和根除帶來困難。同時本病在臨床上常與副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒等混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。該病是國際上公認的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一。胸膜肺炎放線桿菌概述胸膜肺炎放線桿菌（Actinobaci
3、lluspleuropneumoniaeAPP），屬于巴氏桿菌科（Pasteurellaceae）放線桿菌屬（Actinobacillus）。APP是一種革蘭氏陰性小球桿菌，有莢膜，有菌毛，不形成芽胞，無運動性，最近還發(fā)現(xiàn)該菌有鞭毛。胸膜肺炎放線桿菌分兩個生物型，即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide，NAD）依賴型，生物Ⅱ型為非NAD依賴型。血清型是根據(jù)APP表面莢膜和脂多糖抗原性的不同來劃分的，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15種血清型，1型-12型、15型屬于生物Ⅰ型，13、14型屬于生物Ⅱ
4、型。APP菌體形態(tài)（G－）APP主要毒力因子溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）莢膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)轉(zhuǎn)鐵結合蛋白（Tbp）粘附素溶血外毒素（Apx毒素）APP產(chǎn)生的溶血外毒素Apx被認為是APP最重要的毒力因子。在APP的15個血清型中，目前已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生四種不同的溶血毒素（Repeatsinthestructuraltoxin，RTX），稱為Apx（Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx），即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ的毒性最強，表觀分子量為105-11
5、0kDa，具有很強的溶血活性和細胞毒性作用，分泌ApxⅠ的血清型有1、5、9、10和11。毒素Ⅰ型的操縱子包括：毒素激活基因apxⅠC，毒素結構蛋白基因apxⅠA，兩個分泌基因apxⅠB和apxⅠD，其中apxⅠC負責編碼毒素激活蛋白，apxⅠA編碼毒素結構蛋白，apxⅠB和apxⅠD與毒素的分泌有關。apxⅠA基因的N端疏水區(qū)是ApxⅠ的免疫原區(qū)，apxⅠA基因的C端是Ca2+結合區(qū)只對毒素發(fā)揮毒性產(chǎn)生作用。ApxⅡ毒素的表觀分子量為103kDa～105kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。ApxⅡ具有弱的溶血活性，它對肺泡巨噬細胞和嗜中性白
6、細胞也有細胞毒性作用。ApxⅢ毒素的表觀分子量為120kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，ApxⅢ沒有溶血活性，但對肺泡巨噬細胞和嗜中性白細胞有很強的細胞毒性作用。ApxⅣ毒素是新近發(fā)現(xiàn)的。研究人員發(fā)現(xiàn)任何血清型都能在體內(nèi)分泌ApxⅣ毒素蛋白，但體外培養(yǎng)的細菌卻不能分泌該毒素。當apxⅣA與表達載體上的開放閱讀框1（ORF1）在大腸桿菌中表達時，它有微弱的溶血活性和協(xié)同溶血作用（cAMP）。不同Apx毒素的生物學特性Apx毒素類型溶血活性細胞毒性分子量（kDa）分泌的血清型ApxⅠ強強105-1101、5、9、10、11ApxⅡ弱中103-105除
7、了10型以外ApxⅢ無強1202、3、4、6、8ApxⅣ弱弱200所有血清型Apx操縱子基本結構CABD毒素激活基因毒素結構蛋白基因毒素分泌基因胸膜肺炎放線桿菌apxⅠA基因的克隆與原核表達技術路線：apxⅠA基因的克隆與測序重組表達質(zhì)粒的構建與鑒定誘導表達誘導表達條件的優(yōu)化PCR鑒定雙酶切鑒定WesternBlotting不同時間不同IPTG濃度不同溫度apxⅠA基因的擴增引物設計參照GenBank中apxⅠA核酸序列（D16582），應用Primer5.0軟件設計1對引物，其上下游引物中分別含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，預期擴增長度為3158bp，由北
8、京三博遠志生物技術有限公司合成。上游引
