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《PCR核酸熒光定量檢測技術(shù)ppt課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、核酸定量檢測技術(shù)分子雜交定量分析技術(shù)(一)分支鏈DNA信號放大技術(shù)（bDNA)美國Chiron公司,分別以微反應板和瓊脂糖珠為載體，在定量檢測系統(tǒng)中，采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹枝的DNA信號放大探針，分支鏈DNA（branchedDNA）因此而得名。（二）雙抗體夾心雜交法英國MurexDiagnosticsLtd發(fā)明,稱之為Digene系統(tǒng)。該技術(shù)采用兩種抗DNA/RNA雜交體的抗體：一抗為捕獲抗體，直接吸附在微孔反應板上，二抗是偶聯(lián)了AP的標記抗體，通過酶促化學發(fā)光反應檢測DNA/RNA雜交體的信號。真正的核酸探針是RNA，它能特異地與HBVDNA基因組負鏈互補。PC
2、R基因定量技術(shù)PCR擴增循環(huán)過程（一）PCR基因定量基礎(chǔ)Yn=Yn-1*(1+Ev) 0<=Ev=>1 Yn=X*(1+Ev)nLgY=LgX+n×Lg(1+E) LgX=LgY-n×Lg(1+E)決定擴增效率（E)的因素：反應體系方面：反應最佳條件、反應物的相對含量、循環(huán)次數(shù)反應管之間：擴增儀上不同位置標本之間：不同標本中所含有的DNA聚合酶的抑制劑引物和模板的結(jié)合能力模板的含量怎么辦？摸索最佳的實驗條件嚴格實驗室規(guī)范化管理制定規(guī)范化的操作規(guī)程采用內(nèi)標法（二）定量PCR的方法學分類:外標法非競爭內(nèi)標定量PCR內(nèi)標法競爭定量PCR構(gòu)建內(nèi)標物應具備:與靶基因待分析序列比較:相同
3、的引物結(jié)合位點相同的長度相似的堿基排列順序或G+C%含量相似不同的探針結(jié)合位點內(nèi)標法準確定量的原理：YSn=XS*(1+ES)nYIn=XI*(1+EI)nYSnXSYInXI內(nèi)標物的構(gòu)建:靶基因擴增產(chǎn)物的突變限制性片段的插入或缺失含靶基因引物結(jié)合位點的非同源性DNA序列（三）PCR產(chǎn)物的檢測與定量終點檢測法瓊脂電泳掃描檢測法固相捕獲法非探針雜交捕獲法探針雜交捕獲法HPLC檢測法實時檢測法Taqman技術(shù)LightCycler技術(shù)ELISA-PCR技術(shù)一.熒光染料Fam(495nm)Tamra(560nm)L640Tet(520nm)Hex(537nm)L705Tamra/F
4、amTamra/TetTamra/Hex光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子熒光定量PCR技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)熒光標記信號的產(chǎn)生熒光標記探針動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化二.熒光PCR類型特異性熒光探針Taqman雙熒光標記探針molecularBeacon熒光標記探針熒光標記雜交雙探針特異性熒光雙標記探針Taq酶5’→3’外切酶活性Molecularbeacon熒光標記雜交雙探針變性退火延伸結(jié)束三.熒光實時定量PCR的定量原理：Y=X×(1+E)nLgY=LgX+n×Lg(1+E)LgX=LgY-n×Lg(1+E)n=LgY/Lg(1+E)–1/Lg(1+E)×LgX熒光實時PCR的
5、定量概念標準曲線未知標本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target在對數(shù)期進行定量分析的優(yōu)勢擴增效率恒定動態(tài)分析，變化靈敏標準曲線呈線性核酸定量檢測臨床應用免疫學診斷主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學檢測存在較長的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長達70天，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。疾病的早期診斷任何一種抗病毒藥物，以免疫標志物來評價其療效均
6、不夠敏感和及時，若以病毒復制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動態(tài)變化來評價療效，則較為直接和理想。新藥驗證遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測，對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。熒光PCR可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。母嬰傳播的監(jiān)控可對原癌基因的突變和易位等作出檢測；可對原癌基因的mRNA進行定量分析；有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷；探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考；區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應。腫瘤的診
7、斷
