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1、核酸定量檢測(cè)技術(shù)分子雜交定量分析技術(shù)(一)分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)（bDNA)美國(guó)Chiron公司,分別以微反應(yīng)板和瓊脂糖珠為載體，在定量檢測(cè)系統(tǒng)中，采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹枝的DNA信號(hào)放大探針，分支鏈DNA（branchedDNA）因此而得名。（二）雙抗體夾心雜交法英國(guó)MurexDiagnosticsLtd發(fā)明,稱之為Digene系統(tǒng)。該技術(shù)采用兩種抗DNA/RNA雜交體的抗體：一抗為捕獲抗體，直接吸附在微孔反應(yīng)板上，二抗是偶聯(lián)了AP的標(biāo)記抗體，通過酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)DNA/RNA雜交體的信號(hào)。真正的核酸探針是RNA，它能特異地與HBVDNA基因組負(fù)鏈互補(bǔ)。PC
2、R基因定量技術(shù)PCR擴(kuò)增循環(huán)過程（一）PCR基因定量基礎(chǔ)Yn=Yn-1*(1+Ev) 0<=Ev=>1 Yn=X*(1+Ev)nLgY=LgX+n×Lg(1+E) LgX=LgY-n×Lg(1+E)決定擴(kuò)增效率（E)的因素：反應(yīng)體系方面：反應(yīng)最佳條件、反應(yīng)物的相對(duì)含量、循環(huán)次數(shù)反應(yīng)管之間：擴(kuò)增儀上不同位置標(biāo)本之間：不同標(biāo)本中所含有的DNA聚合酶的抑制劑引物和模板的結(jié)合能力模板的含量怎么辦？摸索最佳的實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化管理制定規(guī)范化的操作規(guī)程采用內(nèi)標(biāo)法（二）定量PCR的方法學(xué)分類:外標(biāo)法非競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)標(biāo)定量PCR內(nèi)標(biāo)法競(jìng)爭(zhēng)定量PCR構(gòu)建內(nèi)標(biāo)物應(yīng)具備:與靶基因待分析序列比較:相同
3、的引物結(jié)合位點(diǎn)相同的長(zhǎng)度相似的堿基排列順序或G+C%含量相似不同的探針結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確定量的原理：YSn=XS*(1+ES)nYIn=XI*(1+EI)nYSnXSYInXI內(nèi)標(biāo)物的構(gòu)建:靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的突變限制性片段的插入或缺失含靶基因引物結(jié)合位點(diǎn)的非同源性DNA序列（三）PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與定量終點(diǎn)檢測(cè)法瓊脂電泳掃描檢測(cè)法固相捕獲法非探針雜交捕獲法探針雜交捕獲法HPLC檢測(cè)法實(shí)時(shí)檢測(cè)法Taqman技術(shù)LightCycler技術(shù)ELISA-PCR技術(shù)一.熒光染料Fam(495nm)Tamra(560nm)L640Tet(520nm)Hex(537nm)L705Tamra/F
4、amTamra/TetTamra/Hex光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子熒光定量PCR技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生熒光標(biāo)記探針動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化二.熒光PCR類型特異性熒光探針Taqman雙熒光標(biāo)記探針molecularBeacon熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記雜交雙探針特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶5’→3’外切酶活性Molecularbeacon熒光標(biāo)記雜交雙探針變性退火延伸結(jié)束三.熒光實(shí)時(shí)定量PCR的定量原理：Y=X×(1+E)nLgY=LgX+n×Lg(1+E)LgX=LgY-n×Lg(1+E)n=LgY/Lg(1+E)–1/Lg(1+E)×LgX熒光實(shí)時(shí)PCR的
5、定量概念標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增效率恒定動(dòng)態(tài)分析，變化靈敏標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性核酸定量檢測(cè)臨床應(yīng)用免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在較長(zhǎng)的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長(zhǎng)達(dá)70天，不利于對(duì)疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測(cè)病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷。疾病的早期診斷任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)其療效均
6、不夠敏感和及時(shí)，若以病毒復(fù)制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動(dòng)態(tài)變化來(lái)評(píng)價(jià)療效，則較為直接和理想。新藥驗(yàn)證遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。熒光PCR可對(duì)病原體的母嬰傳播進(jìn)行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。母嬰傳播的監(jiān)控可對(duì)原癌基因的突變和易位等作出檢測(cè)；可對(duì)原癌基因的mRNA進(jìn)行定量分析；有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷；探索癌變發(fā)生機(jī)理的研究提供參考；區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。腫瘤的診
7、斷
