熒光定量PCR檢測項目復(fù)習(xí)過程.ppt

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1、熒光定量PCR檢測項目5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan?ProbeRQTaqman實時PCR的反應(yīng)過程Displacement5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQHydrolysis5’3’5’5’3’5’QRPolymerizationCompleted5’3’5’5’3’5’RQ每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通

2、過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法實時熒光定量PCR原理實時原理常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析實時熒光定量PCR原理　　　　　　定量原理如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進行定量分析介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值擴增曲線擴增曲線圖：橫坐標(biāo)：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收

3、集熒光基團熒光檢測元件熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值Ct值Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)valueCt值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板

4、進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性定量原理理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴增效率定量原理在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣

5、品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample絕對定量25標(biāo)本采集和運送血液標(biāo)本：用2ml真空采集管或1.5ml高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本，血標(biāo)本采集后在2小時內(nèi)送達實驗室（HCV采用EDTA抗凝的血漿）。離心（檢驗單與標(biāo)本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1.5

6、ml的離心管中。腦脊液：由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時送檢。用于臨床標(biāo)本采集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌和密封標(biāo)本采集后，應(yīng)盡可能快的送至實驗室，如運送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實驗室。標(biāo)本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNA測定加入4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）的血清（漿）標(biāo)本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄。注：RNA采用EDTA抗凝的全血標(biāo)本，抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本則盡快（2小時內(nèi)）分離血清。嚴(yán)禁使用肝素抗凝。定量檢測的臨床意義治療前進行病毒定量檢測，指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，

7、避免盲目用藥。治療后定量PCR直接準(zhǔn)確地測定體內(nèi)病毒數(shù)量，有助于療效的判斷。懷孕前進行定量PCR測定，有助于選擇有利的懷孕時機。HBV基因分型HBV基因型是根據(jù)HBV病毒核酸異源性≥8%進行分型分為A、B、C、D、E、F、G、H等8種亞洲主要為B型以及C型感染HBV后的臨床經(jīng)過與不同基因型有關(guān)HBV基因型的臨床意義HBV標(biāo)志物清除與B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg陽性率，分別為16%與53%Ｂ基因型的自發(fā)性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝臟生物化學(xué)指標(biāo)持續(xù)正常。病毒致病性HBsAg陽性者中，C基因型比B基因型的

8、肝功能異常更為常見。C基因型引起的臨床表現(xiàn)及組織學(xué)損傷更嚴(yán)重。乙型肝炎的病程及轉(zhuǎn)歸亞洲無癥狀HBV攜帶中，與B基因型比較,