琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制.ppt

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1、琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制制作人：王承強(qiáng)，汪強(qiáng)，杜金紅問題琥珀酸脫氫酶是哪個代謝途徑中的酶，該酶位于細(xì)胞的什么部位？催化什么化學(xué)反應(yīng)？實驗方案是如何設(shè)計檢查該酶的活性狀況？何為競爭性抑制？本次試驗中選擇的抑制劑是什么？如何設(shè)計實驗方案檢測該酶被抑制的程度？實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)動物的處死與組織勻漿的方法學(xué)習(xí)離心機(jī)的使用方法進(jìn)一步理解酶的競爭性抑制原理實驗原理：競爭性抑制是指分子結(jié)構(gòu)與底物相似的抑制劑可與底物競爭性結(jié)合酶的活性中心，抑制酶的活性。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及于底物的相對比例。草酸與琥珀酸分子結(jié)構(gòu)相似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。

2、在體內(nèi)琥珀酸脫下的2H經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，最后與氧結(jié)合生成水，并釋放能量。在體外則可用甲稀蘭作為受H體，甲稀蘭接受琥珀酸脫下的2H而被還原為甲白，由藍(lán)色變?yōu)闊o色。在甲稀蘭含量一定的條件下，藍(lán)色消退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活性，因此，可以依據(jù)藍(lán)色消退的時間來判斷該酶活性被抑制的程度。離心分離的原理：將處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞器，病毒和生物大分子等稱為“顆?！?，每個顆粒都有一定大小，形狀，密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和方向有關(guān)。實驗器材與試劑：器材：小白鼠，研缽，手術(shù)剪，手術(shù)鑷子，2ml移液管，10ml離心管，低速離心機(jī)

3、試劑pH7.4磷酸緩沖液0.25%琥珀酸鈉溶液0.5%草酸鈉溶液0.01%甲稀蘭溶液生理鹽水實驗操作肝糜液的制備：用頸椎脫臼法處死小白鼠，立即剖腹將肝臟全部取出，用生理鹽水洗凈肝臟，充分研碎至糊狀，然后分批加入少量磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共加入7ml，攪拌后離心約5分鐘（3000rpm）,將上清液倒入另一試管鐘備用，此即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液。另取5支試管，標(biāo)號，按下表操作試劑1號管2號管3號管4號管5號管0.25%琥珀酸鈉液（ml）0.5—0.520.50.5%草酸鈉溶液（ml）—0.50.50.52蒸餾水（ml）221.5——肝糜液（ml）11111甲稀蘭（ml）0.20.20.20.

4、20.2搖勻，靜置于37℃的水浴中，注意觀察各試管的顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時間，并進(jìn)行分析。注意事項：肝臟一定要充分研磨至糊狀，以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液中。離心時注意離心管一定要精確平衡，并將重量相同的離心管對稱放置。（用天平精密平衡離心管和它們的內(nèi)容物，若有套筒，離心管應(yīng)與套筒一起平衡，否則輕者造成離心機(jī)損壞，重者會引起人員傷亡）（平衡后應(yīng)對稱放置，不能錯位，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對稱而損壞離心軸）離心結(jié)束后拿取離心管時動作要輕柔，不能震蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁。反應(yīng)開始后，反應(yīng)液必須靜止，不能再搖動。