生化分析常見交叉污染探討與對策幻燈片

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生化分析常見交叉污染探討與對策徐國超

1一　如何理解交叉污染在A項目測定中所使用的試劑、樣本、反應(yīng)產(chǎn)物、清洗劑等對B項目的測定產(chǎn)生了不良影響的現(xiàn)象。A項目與B項目不一定是相鄰項目。測試項目A試劑、樣本等殘留測試項目B

2引發(fā)交叉污染的原因生化儀的發(fā)展變化①多項目,多樣本處理②處理能力的提高(高速化)設(shè)計共用機(jī)械部分①樣本針,試劑針②比色杯③攪拌棒生化儀狀態(tài)不良,使用不當(dāng)①清洗力的低下(日常維護(hù)欠缺,儀器老化)②生化儀內(nèi)污垢的積聚③測試順序安排不當(dāng)④常規(guī)清洗不能有效消除污染

3二　交叉污染的分類樣本針攜帶污染試劑針攜帶污染攪拌棒攜帶污染清洗系統(tǒng)攜帶污染比色杯污染試劑交叉污染

4三　不同類型交叉污染的鑒別　　方法及原因1.樣本針攜帶污染：目前大多數(shù)全自動生化分析儀采用循環(huán)沖洗式樣本針吸取樣本，當(dāng)樣本針在清洗不完全，或黏附力增加時，樣本殘留可能會對下一相鄰樣本的檢測結(jié)果造成影響。原因：樣品針尖彎曲，特富龍涂層剝落，針堵塞，沖洗水沖洗不充分?jǐn)y帶污染率主要是體現(xiàn)樣品之間的污染程度

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6測試順序：3L2H1L2H4L2H1L2H1L2H1L（注上述順序前的數(shù)字代表測試數(shù)量，如3L代表連續(xù)測試3個低值樣本）定義：L–L值為緊跟在低值標(biāo)本后低值標(biāo)本的結(jié)果。H–L值為緊跟在高值標(biāo)本后低值樣本的結(jié)果攜帶污染指標(biāo)=H–L結(jié)果的平均值–L–L結(jié)果的平均值判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)攜帶污染指標(biāo)小于3SDSD是(L–L)結(jié)果的SD值。樣本針攜帶污染率試驗（二）

7試劑針攜帶污染全自動生化分析儀一般采用雙試劑針，即所有項目的一試劑都共用試劑針R1，所有項目的二試劑都共用試劑針R2。試劑針R1或R2在每吸取一次試劑后都會進(jìn)行一次清洗，之后會立即吸取下一個項目的試劑。當(dāng)自身清洗能力下降，試劑針在吸取試劑時會將部分殘留的前項目試劑成分帶入到后項目反應(yīng)杯中，對后項目的檢測結(jié)果造成影響。從各個項目設(shè)置的參數(shù)可知，試劑體積量遠(yuǎn)大于樣本體積量。因此試劑針攜帶污染影響程度會高于樣本針攜帶污染。

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9攜帶污染實驗方案目前大部分實驗室開展的生化檢測項目至少都有20項以上，評價全項目之間的攜帶污染會非常耗時，試劑成本消耗量大。且不同儀器的動作原理不完全相同，設(shè)計一個較為簡單，合理的實驗方法是需要重點考慮的內(nèi)容。試劑針攜帶污染實驗方案原理：通過設(shè)置特定的標(biāo)本檢測順序，每個樣本只做一個項目的檢測，可以控制不同項目的先后吸取順序，實現(xiàn)任何一個項目都能與其他項目相遇。為了有效評價項目之間攜帶污染影響程度，污染實驗所用病人樣本的混合血清應(yīng)盡量包含醫(yī)學(xué)決定水平濃度

10試劑針攜帶污染實驗方法攜帶污染初實驗假設(shè)本次實驗以A,B,C,D,E五個項目來考察各個項目之間的試劑針攜帶污染,先在生化儀中輸入樣本測試號碼和選擇項目，每個樣本號碼只選擇一個項目，目的是使試劑針吸取項目的順序完全按照樣本測試號碼的先后順序進(jìn)行，五個項目的測試順序見表1。測試完成后，將數(shù)據(jù)輸入到處理表格2和表格3中，按照一定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，尋找可能存在的污染項目組合。

11表3中顯示了試劑之間攜帶污染初實驗后的結(jié)果:a將表格內(nèi)測試順序號代表的位置處輸入該項目對應(yīng)的測試結(jié)果，b對每個測試順序號下面對應(yīng)的測試結(jié)果和該項目單獨5次重復(fù)結(jié)果的均值相比比值以百分比形式表示，通過考察百分比的大小來初步判斷攜帶污染的可能性。目前的判斷標(biāo)準(zhǔn)以正負(fù)百分之五作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，超過范圍時懷疑有攜帶污染。

12試劑針攜帶污染確認(rèn)實驗由攜帶污染初實驗篩選出懷疑有污染的項目組合，假設(shè)(A→B)同(D→E)即A項目對B項目（A項目做好后緊接著做B項目），D項目對E項目（D項目做好后緊接著做E項目）懷疑有污染。由于初實驗的項目交叉結(jié)果只是一次測試的結(jié)果，可能有偶然因素，還必須進(jìn)行確認(rèn)實驗。以(A→B)為例，(D→E)的情況相同先單獨做A項目，緊接著連續(xù)測試3次B項目，第一個B項目的結(jié)果受A項目影響最大，第三個B項目的結(jié)果因為有2次自身沖洗，結(jié)果應(yīng)比較準(zhǔn)確。比較第一個B項目檢測結(jié)果同第三個B項目檢測結(jié)果，如果影響百分比同初試結(jié)果影響趨勢和程度相近，可以判斷A項目對B項目有攜帶污染。確認(rèn)實驗檢測順序以(A→B）,(D→E)為例確認(rèn)實驗步驟（表4）AB1B2B3DE1E2E3

13攪拌棒污染：試劑與樣本、第一試劑與第二試劑的混勻需要攪拌棒，而攪拌棒如果清洗不完全，或黏附力增加時，殘留試劑可能會對下一檢測結(jié)果造成影響。鑒別對同一份血清標(biāo)本重復(fù)測定GGT或ALT或　　　AST20次以上，結(jié)果重復(fù)性較差且有走高趨勢。原因攪拌棒特富龍涂層剝落，攪拌棒表面有頑固性　　　　污漬，沖洗水沖洗不充分,可用無水乙醇擦洗攪拌棒攪拌棒攜帶污染

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154.清洗系統(tǒng)攜帶污染鑒別：在樣本測定過程中加做室內(nèi)質(zhì)控，部分項目測定異?；蛘呤Э卦跇颖緶y定過程中以蒸餾水為樣本，多次測定LDH、P、Mｇ、TBA，結(jié)果重復(fù)性不好。原因：干燥棒攜帶污染為多

165.比色杯污染生化分析儀的比色杯大體分為兩種，一種是循環(huán)使用的（如石英比色杯等），另一種是需要定期更換的（如塑料比色杯等），每個比色杯檢測完畢后，進(jìn)行清洗，然后繼續(xù)下一個檢測項目的檢測。當(dāng)由于各種原因?qū)е履硞€比色杯清洗不完全或該比色杯老化時，吸附在比色杯上的上一個項目的殘留試劑可能會對在這個比色杯中進(jìn)行的下一個項目的檢測結(jié)果造成影響。根據(jù)經(jīng)驗，比色杯的污染對結(jié)果影響最大，因為比色杯最難以清洗干凈，且在實際工作中難以判斷該比色杯上一測試的項目。鑒別：在每日早晨剛開機(jī)時對所有項目做試劑空白測定，試劑空白吸光度高（終點法）或者試劑空白吸光度變化率高（速率法）TBA（循環(huán)酶速率法）經(jīng)常出現(xiàn)負(fù)值蛋白項目、血脂項目結(jié)果偏高膽紅素（釩酸鹽法）易出現(xiàn)異常值原因：比色杯劃痕較深較多，清洗系統(tǒng)清洗不徹底

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18比色杯污染實驗方法以項目A對B﹑C﹑D﹑E4個項目比色杯污染

19不同類型的交叉污染的發(fā)生幾率由高到低排列：試劑針攜帶污染攪拌棒攜帶污染比色杯污染樣本針攜帶污染清洗系統(tǒng)攜帶污染

20用排除法鑒別不同類型的交叉污染的排列順序（在保證試劑質(zhì)量沒有任何問題的前提下）：樣本針攜帶污染比色杯污染試劑針攜帶污染攪拌棒攜帶污染清洗系統(tǒng)攜帶污染

21試劑交叉污染---類型1.試劑成分間的直接影響2.試劑成分間的間接影響3.反應(yīng)進(jìn)程相同4.影響反應(yīng)條件

22試劑交叉污染1.試劑成分間的直接影響前一個測定試劑中直接含有后一個測試試劑所要測定的項目。例如：通常在AMY的R1試劑中含有Ca離子（酶活化劑）,當(dāng)某樣品作AMY和Ca這兩個檢測項目時，檢測的順序是先檢測AMY，接著檢測Ca。因吸取過AMY的R1試劑針上可能沾有殘留的R1試劑，所以當(dāng)R1試劑針再吸取Ca試劑時，會引入AMY的R1試劑中含有的Ca離子，這樣對Ca項目的檢測結(jié)果就可能造成正誤差

23試劑交叉污染常見試劑成分間的直接影響葡萄糖（GLU）（氧化酶法）、總蛋白（TP）與酸性磷酸酶（ACP）試劑中含有較高濃度的鉀（K+）；膽堿酯酶（ChE）、總膽固醇（CHOL）、GLU（GOD法）、尿酸（UA）（尿酸酶法）、乳酸脫氫酶（LD）（IFCC法）、羥丁酸脫氫酶（HBDH）（DGKC法）等試劑中含有磷酸緩沖液；CHOL、TG試劑及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑中含有膽酸鈉；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（IFCC法）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（IFCC法）試劑中含有高活性的LD；以上試劑的交叉污染就分別會對、K+（紫外酶法）、磷（P）、總膽汁酸（TBA）及LD的測定結(jié)果造成干擾

24試劑交叉污染2.試劑成分間的間接影響試劑成分參與反應(yīng)：上一個試劑中含有的某種試劑成分與下一反應(yīng)所要測定的底物有作用，因而干擾下一反應(yīng)的測定結(jié)果。如：Mg2+測定試劑的絡(luò)合劑亦能與鐵（Fe）結(jié)合，影響鐵與鐵絡(luò)合劑的結(jié)合；直接膽紅素（DBil）（重氮法）試劑含有EDTA，Mg2+試劑中含有EDTA，均能與Ca結(jié)合，從而影響Ca的測定；以甘油作為酶保護(hù)劑的試劑，會對TG的測定帶來干擾；鈣（MTB法）試劑對K+有負(fù)干擾；CHOL試劑中含有膽固醇酯酶，可水解膽固醇酯形成游離膽固醇，而引起對游離膽固醇測定的干擾。

25試劑交叉污染（3）反應(yīng)進(jìn)程相同：上一個試劑所引導(dǎo)的反應(yīng)對下一個項目的反應(yīng)進(jìn)程帶來間接的干擾，下一項目所測定的是前后兩個項目反應(yīng)的綜合作用結(jié)果。如：當(dāng)上一反應(yīng)產(chǎn)物為H2O2時，則對以Trinder反應(yīng)產(chǎn)生顏色的測定結(jié)果引起干擾，如UA對CHOL結(jié)果的影響，CHOL對肌酐（CREA）（酶法）測定結(jié)果的影響，GLU（氧化酶法）對CREA測定結(jié)果的影響；CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）試劑中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶（HK）反應(yīng)過程，因此可能對GLU的測定帶來干擾，尤其對GLU的HK法測定可能帶來嚴(yán)重干擾。

26試劑交叉污染（4）影響反應(yīng)條件：如上一試劑緩沖液成分改變了下一反應(yīng)的pH環(huán)境，從而改變反應(yīng)速率，如TP（雙縮脲法）測定需在pH8～9時，蛋白肽鍵才都能與堿性銅溶液作用生成紫色反應(yīng)，若pH＜8時，則會導(dǎo)致TP結(jié)果偏低，還直接影響球蛋白、白蛋白/球蛋白的結(jié)果；酶活性測定有最適pH，大多數(shù)酶反應(yīng)pH在6.0～7.5之間，ALP、γ-GT、LDH則在堿性條件下最適宜；CREA（苦味酸速率法）反應(yīng)條件為堿性，果糖胺（動力學(xué)法）反應(yīng)條件為酸性，受到污染后反應(yīng)速率會減慢。CREA（酶法）試劑中含有抗壞血酸氧化酶，影響了氧化還原反應(yīng)的進(jìn)程，會對TBA（酶循環(huán)法）測定結(jié)果有影響。DBil（釩酸鹽氧化法）試劑中含有表面活性劑的酒石酸鹽緩沖液會影響ALT活性，對測定結(jié)果有負(fù)干擾。

27如何消除試劑間的化學(xué)污染（1）為減少試劑間的化學(xué)污染，應(yīng)定期對儀器進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋ｐB(yǎng)，如更換管道，用去污劑、酸性洗液清洗比色杯，用去污劑擦清試劑針，用無水乙醇擦洗攪拌棒等。（2）合理安排檢測項目的順序：一般在安排項目順序時要求兩個項目間至少要有一個非干擾項目，由于各廠商試劑盒原理不同，內(nèi)含成分不同，故無固定的測定順序格式，需要自己摸索。較好的做法是將被干擾項目置于干擾項目之前，以消除干擾發(fā)生的可能。一般檢測順序有以下原則：①不受上一試劑的干擾；②不影響下一試劑測定；③不影響測試速度；④充分運(yùn)用剩余試劑位開展新項目；⑤利用好儀器的功能。（3）當(dāng)合理設(shè)置測試順序無法消除交叉污染時，可使用生化分析儀的試劑針、比色杯清洗程序，對試劑針、比色杯進(jìn)行2次或多次清洗。用堿性清洗液及酸性清洗液交叉沖洗試劑針可以有效地避免攜帶污染。（4）選用具有抗交叉污染的試劑盒：如在游離膽固醇試劑中添加膽固醇酯酶抑制劑，以減少膽固醇酯酶水解膽固醇酯而引起對游離膽固醇測定的污染。（5）部分大型全自動生化分析儀有多個模塊或通道，可以將有化學(xué)污染干擾的項目排在不同的模塊或通道中檢測。

28第一類：前一測試項目試劑中含有緊跟其后測試項目所要測定的底物。此時殘留的污染物被帶入下一測試中，與該測試的試劑反應(yīng)，可能會導(dǎo)致結(jié)果異常。引起這類交叉污染產(chǎn)生的物質(zhì)明確，并且可以定量分析。主要項目有：1.ALT(IFCC法),AST(IFCC法)含高活性的LDH,會影響其后的LDH結(jié)果。2.CK-NAC、CK-MB-NAC酶偶聯(lián)測定試劑含高濃度Glucose,會干擾其后的血糖測定，尤其對HK法干擾嚴(yán)重。3.Glu(GOD法)、UA(尿酸酶法)、a-HBDH、TG、Ca(偶氮胂III法)、TC(CHOD-PAP)等均采用磷酸鹽緩沖液,會干擾位于其后無機(jī)鹽(P)的結(jié)果。4.ALP(IFCC-AMP法)，CK-NAC,CK-MB-NAC,TG(GPO法)試劑均含高濃度Mg2+會影響緊隨其后的Mg2+的結(jié)果。5.TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C采用膽固醇氧化酶法的試劑含膽酸鈉，會干擾緊跟其后的TBA結(jié)果，致假性偏高。6.以對一硝基苯麥芽七糖苷法(4NP-G4)為底物的AMY試劑含Ca2+濃度高會影響其后測Ca2+的準(zhǔn)確性。7.TG，TC試劑中有LIP，會導(dǎo)致LIP的測試結(jié)果不真實。該種類型的交叉污染單試劑終點法的受污染項目測試結(jié)果的抬高或降低反映的是攪拌桿的攜帶污染。因為試劑針攜帶進(jìn)來的上一個測試的干擾物會和下一個試劑發(fā)生反應(yīng)，由于攜帶量小，一般在試劑空白段（2min）即反應(yīng)平衡。而雙試劑項目的測試結(jié)果反映的是試劑針和攪拌桿的綜合污染。

29第二類：前一測試項目試劑中的某種（些）成份干擾緊隨其后測試項目所要測定的底物。引起這類交叉污染產(chǎn)生的物質(zhì)明確，但和第一類不同的是，前一測試殘留并帶入下一測試的污染物并非待測物本身，而是能與待測物進(jìn)行其他的反應(yīng)或顯色物質(zhì)波段重疊或引起測試條件的變化如PH值改變等，從而帶來對測試過程的干擾，這種干擾作用不易進(jìn)行定量分析。主要項目有：1.TC、HDL-C、HDL-C、LDL-C最終反應(yīng)都是過氧化氫和4-氨基安替比林在過氧化酶的作用下產(chǎn)生醌亞胺顯色（505nm），因此這些項目間會相互干擾。2.TP的檢測原理是蛋白質(zhì)與銅離子生成紫藍(lán)色復(fù)合物，該顯色物質(zhì)在546nm有吸收峰，在波段500nm~600nm都有較大吸收；因此TP試劑可能影響500nm-600nm波段的終點法顯色測定（如TC，TG，UA等）。另外，TBIL（重氮法）和DBIL（重氮法）生成的偶氮物在546nm下有吸收峰，因此TBIL（重氮法）或D-BIL（重氮法）會和TP相互干擾。3.ALB（BCG）檢測原理是形成的藍(lán)綠色復(fù)合物在578nm有強(qiáng)吸收，且在整個500nm-700nm都有較強(qiáng)吸收，因此ALB試劑會干擾緊隨其后的500nm-700nm波段的終點法顯色測定（如UA等）。4.ALT的R2（含NADH）及CR的R2試劑（苦味酸，呈深黃色）在340nm有很強(qiáng)的吸收，會干擾緊隨其后的340nm免疫比濁終點法的測定（如PA，CRP等），且免疫比濁法的終點吸光度越低干擾越嚴(yán)重。該種類型的交叉污染無法分出是試劑針還是攪拌桿攜帶進(jìn)的污染對測試結(jié)果的影響，是兩者的綜合影響。

30四　解決方案1.當(dāng)交叉污染程度較輕時，設(shè)置防交叉污染清洗程序，增加對樣本針、試劑針、比色杯的清洗次數(shù)。2．合理設(shè)置實驗項目的排列順序，避免試劑交叉污染。ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALP、GGT、CHE、TP、Alb、Urea、UA、Cr、CK、CK-MB、α–HBDH、LD、Glu、TG、TC、HDL-C、LDL-C、APOAI、APOB、Amy、CO2、P、Fe、Ca、Mg。(僅供參考)3．當(dāng)交叉污染程序較重時，應(yīng)對儀器做大保養(yǎng)和維修，更換相應(yīng)部件。4.　每個實驗項目所需的樣本量、試劑量不要隨意同比例降低，以保證反應(yīng)液保持較大的緩沖能力。

31設(shè)置特殊清洗程序?qū)嶒灧椒ㄍ_認(rèn)實驗，假設(shè)確認(rèn)實驗確認(rèn)了A項目對B項目存在污染。在儀器中設(shè)置A項目B項目進(jìn)行特殊清洗。選擇特殊清洗液（儀器內(nèi)部水，堿性清洗液，酸性清洗液）。一般先設(shè)置儀器內(nèi)部水，設(shè)置清洗液量，可根據(jù)項目參數(shù)中的試劑液量輸入。輸入特殊清洗程序后，按AB1B2B3的測試順序，進(jìn)行清洗效果確認(rèn)，考察B1/B3的比值，確認(rèn)是否達(dá)到清洗效果。

32設(shè)置清洗程序,清洗效果確認(rèn)判定有污染水清洗污染污染消除堿性清洗液污染污染消除酸性清洗液污染污染消除調(diào)整測試順序等其他方法

33五　注意事項1．當(dāng)交叉污染較嚴(yán)重時，往往是幾類污染同時存在。2．項目編排順序要與試劑瓶安放順序保持一致。試劑應(yīng)盡量選用大容量瓶盛裝。3．試劑針攜帶污染與攪拌棒攜帶污染的現(xiàn)象有很多共同點，鑒別較復(fù)雜。

34污染是檢驗工作中的麻煩制造者(偶發(fā)性,無可預(yù)測性)清洗程序設(shè)定過多樣本處理速度降低不運(yùn)用清洗程序浪費儀器功能通過污染實驗,了解實際污染現(xiàn)狀,運(yùn)用,設(shè)定清洗程序最大程度消除污染,最大程度保證處理速度

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