肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

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1、肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析：施孟如，林全，鄭易，王良興【摘要】目的：建立肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液的雙向電泳圖譜，分析二者蛋白質(zhì)表達(dá)的差異和特點(diǎn)。方法：選取肺腺癌伴胸腔積液標(biāo)本12例，肺鱗癌伴胸腔積液標(biāo)本8例，以固相pH梯度等電聚焦為第一向，垂直板SDS-PAGE為第二向分離胸水蛋白質(zhì)，銀染顯色，掃描儀獲取凝膠圖像并對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果：同組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，其中肺腺癌胸腔積液蛋白質(zhì)點(diǎn)平均(376±17)個(gè)，同組匹配率為88.3%;肺鱗癌胸腔積液蛋白質(zhì)點(diǎn)平均(383±21)個(gè)，同組匹配率為8

2、6%。經(jīng)軟件分析，肺腺癌胸腔積液中表達(dá)增高2倍的差異蛋白點(diǎn)29個(gè)，降低50%的蛋白質(zhì)點(diǎn)50個(gè)。有3個(gè)點(diǎn)僅在肺腺癌胸腔積液表達(dá)，5個(gè)點(diǎn)僅在肺鱗癌胸腔積液中表達(dá)。結(jié)論：肺腺癌與肺鱗癌胸腔積液差異蛋白可能是不同病理類型的肺癌細(xì)胞分泌的特殊蛋白或特異性蛋白標(biāo)志物?！娟P(guān)鍵詞】胸腔積液;肺腺癌;肺鱗癌;雙向電泳;蛋白質(zhì)組肺癌是引起胸腔積液最常見(jiàn)的原因之一[1]。目前臨床上主要采用胸水脫落細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)室生化檢查等方法來(lái)鑒別胸腔積液的原因。利用雙向電泳分離蛋白質(zhì)，能夠從大量蛋白質(zhì)中直接篩選出特異蛋白質(zhì)，為很多疾

3、病的發(fā)病機(jī)制研究和臨床診斷提供依據(jù)[2-3]。本研究利用雙向凝膠電泳技術(shù)分析肺腺癌與肺鱗癌胸水的蛋白質(zhì)組，試圖為尋找不同類型肺癌相關(guān)蛋白或特異性蛋白標(biāo)志物打下基礎(chǔ)，為腫瘤的診斷、分型、藥物研究帶來(lái)新的思路和途徑。　　1材料和方法　　1.1主要試劑和儀器丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、超純尿素(ultraurea)、硫脲(thiourea)、3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰氨、固相pH干膠條(17cm，pH4～7)，Bi

4、o-lytepH3～10，2-Dcleanup試劑盒等(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制劑混合液protaseinhibitorcocktail(Sigma公司)，所有溶液均用MilliQ水配制?！　ROTEANIEFCELL等電聚焦儀，PROTEANⅡXi垂直板電泳儀及其附件，GS-800掃描成像系統(tǒng)，PDQuest凝膠圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，UV2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司)?！　?.2標(biāo)本溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2007年11月-2008年6月門診及住院患者20例

5、，年齡32～78歲。肺腺癌伴胸腔積液12例，肺鱗癌伴胸腔積液8例，所有病例均經(jīng)支氣管鏡組織活檢和刷取涂片細(xì)胞學(xué)檢查所確診?！　?.3實(shí)驗(yàn)方法　　1.3.1標(biāo)本制備：每例胸腔積液標(biāo)本各取10mL，同組標(biāo)本混合后4℃，4000r/min離心10min，取上清液。所有標(biāo)本按照1:4(V/V)比例加入10%TCA-丙酮溶液，混勻后于-20℃放置過(guò)夜，4℃，14000r/min，離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮，4℃，14000×g，離心5min，洗2次，棄上清，沉淀用裂解液(8mol/L尿素，4

6、%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte)重懸后用Bradford法[4]測(cè)蛋白質(zhì)濃度，-80℃冰箱保存?zhèn)溆??！　?.3.2雙向凝膠電泳：參考文獻(xiàn)[5]方法，根據(jù)樣品情況適當(dāng)改進(jìn)。第一向——固相pH梯度等電聚焦凝膠電泳，采用低電壓膠內(nèi)泡脹法，將200μg蛋白樣品與上樣緩沖液(8mol/L尿素，2%CHAPS，50mmol/LDTT，0.2%Bio-Lyte，0.001%溴酚藍(lán))共300μL混合后加入聚焦盤中，選用pH4～7線性17cm膠條，IPG膠條膠面朝下放入水化液，加蓋

7、3mL礦物油。聚焦參數(shù)見(jiàn)表1。等電聚焦后的IPG膠條依次在含1%DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液(6mol/L尿素，2%SDS，50mmol/LTris-HClpH8.8，20%甘油)中各平衡15min，轉(zhuǎn)移至8%～16%線性梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封頂?！　〉诙颉猄DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：以恒流10mA/gel電泳15min，再加大電流至30mA/gel直至溴酚藍(lán)達(dá)到膠的底端。按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行高靈敏度的銀染?！　?.3.3凝膠圖像的采集和分析

8、：凝膠用GS-800圖像掃描儀透射掃描，分辨率為：63.5×63.5microns。圖像配比分析采用PDQuest7.4.0進(jìn)行詳細(xì)分析、比較蛋白質(zhì)點(diǎn)差異?！　?結(jié)果　　2.1肺腺癌胸腔積液組和肺鱗癌胸腔積液蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的建立在相同條件下，同組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用PDQuest軟件分析，其中肺腺癌胸腔積液蛋白質(zhì)點(diǎn)平均(376±17)個(gè)，同組匹配率為88.3%;肺鱗癌胸腔積液蛋白質(zhì)點(diǎn)平均(383±21)個(gè)，同組匹配率為86%。蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜(見(jiàn)圖1)，從左到右等電點(diǎn)增加，從下往上分子質(zhì)量增加