犬細(xì)小病毒vp2基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)犬細(xì)小病毒vp2基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)的論文

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1、犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)的論文【摘要】目的表達(dá)犬細(xì)小病毒vp2蛋白（cpvvp2），用于犬細(xì)小病毒病的診斷、疫苗研制和vp2蛋白功能研究。方法采用pcr方法對(duì)cpvvp2基因進(jìn)行擴(kuò)增，將cpvvp2基因克隆到畢赤酵母(pichiapastoris)分泌表達(dá)載體ppiczαa中，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體ppiczαavp2，將該重組質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌gs115中，在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)cpvvp2，sdspage和ing2，caozhen2，edicineofch

2、ineseagricultureuniversity，beijing100094；2.nationalveterinarydiagnosticcenterofministryofagriculture，beijing100094，china)【abstract】objectivetoestablishayeastpichiapastorisexpressionsystemexpressingcanineparvovirusvp2protein(cpvvp2)toservethediagnosisofcpv，developmentofcp

3、vvaccineandresearchofvp2proteinfunction.methodscpvvp2geneplifiedbypcr，clonedintosecretorypichiapastorisexpressionvectorppiczαa，andedppiczαavp2.afterbeinglinearizededigestion，thevectoredintopichiapastorisgs115byelectroporationmethod.thecpvvp2proteinexpressedethanolinduct

4、ion.theexpressedproteininyeastplified，sdspageandagainstcpv.conclusioncpvvp2hasbeensuccessfullyexpressedinyeastpichiapastoris.theexpressedcpvvp2proteinsharesreactionagainstcpv.【key109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自promega公司，c表達(dá)載體ppiczαa、畢赤酵母gs115菌株及抗生素zeocintm購(gòu)自invitrogen公司。1.1.2主要試劑、試劑盒及培養(yǎng)基：限制

5、性內(nèi)切酶ecorⅰ、xbaⅰ、sacⅰ、dnamaker購(gòu)自大連寶生物技術(shù)有限公司；taqdnapolymerase、dntp、t4dna連接酶購(gòu)自promega公司。小量膠回收試劑盒、酵母基因組dna提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司，質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自博大泰克公司，低鹽lb、ypd、mdh、mmh、bmgy、bmmy等培養(yǎng)基均按照invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)說明書配制［2］。辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗犬酶標(biāo)二抗購(gòu)自中杉公司。1.1.2引物:根據(jù)已發(fā)表的cpv的vp2基因dna序列，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物中

6、含有ecori限制性酶切位點(diǎn)，下游引物中含有xbai限制性酶切位點(diǎn)，重組表達(dá)質(zhì)粒的pcr鑒定所用引物根據(jù)表達(dá)載體ppiczαa上的5′aox1和3′aox1引物位點(diǎn)合成，引物由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物vp2f：5′gcgaattcatgagtgatggagcagtt3′;下游引物vp2r：5′actctagatataattttctaggtgc3′;pcr鑒定引物：5′aox1：5′gactggttccaattgacaagc3′;3′aox1：5′gcaaatggcattctgacatcc3′;使

7、用液濃度為10pmol/μl。1.2方法1.2.1cpvdna的提?。翰捎梅营猜确陋伯愇齑挤椒ㄌ崛〔《綿na，沉淀用50μl雙蒸水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr擴(kuò)增vp2基因：以上步提取的dna為模板，利用特異性引物vp2f/vp2r擴(kuò)增vp2基因。pcr反應(yīng)體系20μl：ddh2o8μl，10×pcrbuffer2μl，2.5mmol/ldntp2μl，15mmol/lmg2+2μl，10pmol/μl目的基因上下游引物混合液2μl，0.5u/μltaqdna聚合酶2μl，cpvdna模板2μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性8mi

8、n；94℃變性2min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。95℃預(yù)變性8min后立即加入taqdna酶。pcr產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳。1.2.3表達(dá)載體ppic