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《農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青稞遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青稞遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的研究第一章文獻(xiàn)綜述1.1大麥組織培養(yǎng)研究進(jìn)展植物遺傳轉(zhuǎn)化是指通過某種途徑或技術(shù)將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)并穩(wěn)定的整合表達(dá)與遺傳的過程。組織、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立，為植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了理想的受體材料[8]。從20世紀(jì)70年代開始，有學(xué)者已在大麥中開展了組織培養(yǎng)技術(shù)[9,10]。然而，在大麥的離體培養(yǎng)中，基因型和培養(yǎng)基是十分重要的影響因素，因此，針對不同基因型的遺傳背景，選擇合適的培養(yǎng)基，對提高和穩(wěn)定大麥的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)率是至關(guān)重要的。國內(nèi)外對此也已有很多相關(guān)的報道。很多研究表明，基因型是大麥組織培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵因素，不同的基因型其愈傷組織
2、誘導(dǎo)、分化以及植株的再生能力均有所不同。大麥遺傳轉(zhuǎn)化中，野生大麥GoldenPromise作為模式品種[11,12]。此外，近年來，很多學(xué)者為了突破上述模式品種的限制，以大面積推廣種植的優(yōu)良大麥品種為研究對象建立遺傳轉(zhuǎn)化體系方面做了很多的研究，并取得的一些成果。高潤紅等以集優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病、抗逆等優(yōu)點于一身的大麥品種花30為試驗材料，通過條件優(yōu)化，使得愈傷組織誘導(dǎo)率及綠苗分化率達(dá)到一個較高的水平，分別可達(dá)93.3%和46.67%[13]。陳升文等通過比較14個不同基因型青稞品種的成熟胚再生體系，結(jié)果表明，品種基因型極顯著地影響青稞成熟胚出愈率，并從中篩選出適合成熟
3、胚培養(yǎng)的生產(chǎn)應(yīng)用的青稞品種[14]。李靜雯等通過農(nóng)桿菌侵染不同的大麥品種，結(jié)果表明，甘肅省大面積推廣的啤酒大麥優(yōu)良品種甘啤4號抗性愈傷組織獲得率可高達(dá)46.4%，是模式品種GoldenPromise愈傷組織獲得率的2.5倍[15]。萬萌等以本單位育成的大麥品種華大麥4號、7號與Goldenpromise做比較，雖然愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率略低于GoldenPromise，但均能達(dá)到90%以上[16]。同樣以模式品種為對照，韓勇等發(fā)現(xiàn)，除了模式品種外，早熟3號和冬17的愈傷組織誘導(dǎo)率分別可達(dá)78.4%和64.8%，其植物再生率分別為17.3%和32.7%，均以模式品種
4、GoldenPromise的再生能力相當(dāng)。1.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展目前，在進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化時所常用的基因槍法、電擊法、花粉管通道法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等方法中，研究最多、理論和機(jī)理較清楚的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)原理是：首先，運(yùn)用分子生物學(xué)中基因重組的方法改造農(nóng)桿菌，將Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域上原有的致瘤基因去除，然后將目的基因插入到農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)域中。其次，讓農(nóng)桿菌侵染受體細(xì)胞，在侵染過程中天然的將目的基因轉(zhuǎn)移整合到植物染色體組并使之表達(dá)。1997年，首次報道根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化的成功實例[2]。與基因槍法相比，利用農(nóng)桿菌
5、介導(dǎo)法進(jìn)行的大麥遺傳轉(zhuǎn)化具有轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定、轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象少等優(yōu)點，因此受到了越來越多人的關(guān)注[3,11,15,65]。影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素很多。其中除了上述大麥愈傷組織誘導(dǎo)率之外，農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)過程也是影響大麥轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，其中包括農(nóng)桿菌菌株、侵染方法、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間等等。.第二章青稞幼胚再生體系構(gòu)建的初步研究植物的組織培養(yǎng)技術(shù)是實現(xiàn)植物外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的前提。與其他組織或者器官相比較，植物的未成熟胚作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生時，愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，其植株的再生率也保持較高水平[81-83]。因此，在大麥的再生體
6、系研究中，國內(nèi)外很多學(xué)者以大麥幼胚作為外植體進(jìn)行大麥的組織培養(yǎng)[15,30,41,84]。然而，大麥幼胚再生體系的構(gòu)建研究大多基于模式大麥GoldPromise，而適應(yīng)于此品種的組織培養(yǎng)技術(shù)并不完全適合其他大麥和裸大麥品種。而青稞（裸大麥）幼胚再生體系研究比較薄弱，目前為止未見相關(guān)報道。因此，本研究選取了20世紀(jì)60年代從甘肅省甘南州引進(jìn)以來一直在青海省有大面積種植的青稞品種肚里黃為研究對象，以適時的幼胚為外植體，初步研究了不同接種時間及不同滅菌時間對幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響，從而為構(gòu)建和完善青稞幼胚再生體系奠定基礎(chǔ)。2.1材料2.1.1供試品種供試品種肚里黃為20
7、世紀(jì)60年代從甘肅省甘南州引進(jìn)的青稞農(nóng)家品種。自引進(jìn)以來，目前為止在青海省青稞種植區(qū)均有大面積種植。參試肚里黃種子由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物所青稞研究室提供。2.2方法2.2.1幼胚的選材及接種晴天取揚(yáng)花后12-16d的青稞幼穗，剝?nèi)シN皮后用蒸餾水沖洗3次，超凈工作臺中用75%酒精浸泡1min后無菌水清洗3-4次，再用5%NaClO浸泡10min后無菌水清洗3-5次，無菌濾紙吸干水分后置于經(jīng)滅菌處理過的墊有無菌紙的培養(yǎng)皿中，挑取幼胚、盾片朝上接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中外植體幼胚接種數(shù)為200個。2.2.2愈傷組織的繼代每2周將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的初級愈傷組織轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上繼代
8、1次，每次
