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《基因相關(guān)肽的制備及其應(yīng)用的初步研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、基因相關(guān)肽的制備及其應(yīng)用的初步研究摘要】目的:對hPTH(1?34)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，提高蛋白水解酶的穩(wěn)定性，增強(qiáng)酶活性，使之更適合制成滴鼻劑，并驗證治療骨質(zhì)疏松癥的效果。方法：確定將hPTH(1?34)改造成為Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro后，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pED?4PhPTH(1?34)，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)LysE，乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)分離純化獲得目的多肽。將目的多肽與二甲基?β?環(huán)糊精、聚丙烯酸、EDTA制成滴鼻劑，治療卵巢摘除大鼠（OVXedRats）的骨質(zhì)疏松癥。結(jié)果：獲得純度較高的Pro?Pro?[Arg1
2、1]hPTH(1?34)?Pro?Pro，將制成的滴鼻劑用于卵巢摘除大鼠，與生理鹽水滴鼻治療組相比能顯著增加大鼠椎骨骨密度（P<0.01）及股骨頭骨小梁厚度（P<0.001），對鼻黏膜沒有損傷。結(jié)論：Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro制成滴鼻劑治療卵巢摘除大鼠的骨質(zhì)疏松癥效果明顯，有進(jìn)一步開發(fā)的前景。【關(guān)鍵詞】人甲狀旁腺素滴鼻劑骨質(zhì)疏松癥骨密度骨小梁骨質(zhì)疏松癥是一種老年人和絕經(jīng)后婦女的常見疾病，容易造成骨折，降低生活自理能力。甲狀旁腺素（PTH）是一種由甲狀旁腺分泌的激素，由84個氨基酸組成，是血鈣的主要調(diào)節(jié)劑之一[
3、1]。PTH小劑量多次給藥具有明顯的成骨作用，PTH（1?34）則完全保留了這種活性，所以PTH（1?34）成為目前治療骨質(zhì)疏松的理想藥物[1?2]。PTH及其相關(guān)肽類藥物都采用注射給藥，頻繁給藥給患者帶來極大的不便和痛苦。與注射劑相比滴鼻劑具有使用方便、患者依從性較好等特點，因此開發(fā)PTH（1?34）的滴鼻劑具有廣闊的市場前景。多肽類藥物滴鼻給藥，透過鼻黏膜吸收比較困難，而且易被吸收過程中的蛋白酶所降解[3]，除了從藥劑學(xué)上來解決此問題，我們認(rèn)為有必要對hPTH（1?34）進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。結(jié)構(gòu)改造有兩個目的，一方面為了增強(qiáng)其對蛋白酶的穩(wěn)定性，避免吸收過程中酶的
4、降解，另一方面增強(qiáng)其活性，彌補(bǔ)多肽類藥物生物利用度較低的不足。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，我們選定將hPTH（1?34）改造為Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro，采用基因工程的方法來獲得該肽，并制成滴鼻劑治療卵巢摘除大鼠的骨質(zhì)疏松癥驗證其藥效。1材料與方法1.1材料pET28ansB?C為本實驗室構(gòu)建保存，pET?28a購自TaKaRa公司，大腸桿菌BL21（DE3）為本實驗室保存，CM52購自?β?CD）購自Sigma公司，SD大鼠由中國藥科大學(xué)動物實驗中心提供，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1Pro?Pro?[Arg
5、11]hPTH(1?34)?Pro?Pro表達(dá)和純化通過PCR方法我們合成編碼Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的DNA片斷，并將其插入質(zhì)粒pET28ansB?C的BamHⅠ和HindⅢ兩個酶切位點之間得到表達(dá)質(zhì)粒pED?4PhPTH(1?34)。在該表達(dá)質(zhì)粒中，Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro是通過酸敏感位點Asp?Pro連接到大腸桿菌門冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。將該質(zhì)粒測序驗證后，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)LysE后進(jìn)行表達(dá)，然后經(jīng)包涵體洗滌，8mol·L-1尿素溶解，乙醇
6、分級沉淀獲得融合蛋白，再經(jīng)酸水解，CM?52柱層析獲得目的多肽。1.2.2Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的HPLC分析反相柱為Shim?packCLC?ODS6.0mmID×15cm，A相為0.1%的三氟乙酸水溶液，B相為純乙腈，梯度為B相從20%到70%，洗脫時間為20min，流速為1ml·min-1，檢測波長為280nm，進(jìn)樣量為20μl，溫度為室溫。1.2.3Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro滴鼻劑的制備及對卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療將不同質(zhì)量濃度的Pro?Pro?[Arg11]hPT
7、H(1?34)?Pro?Pro（2.500、1.250和0.625mg·ml-1）、DM?β?CD(40mg·ml-1)、聚丙烯酸（2.5mg·ml-1）及EDTA?Na（0.1mg·ml-1）溶解到生理鹽水中，調(diào)pH6.0，配制成高、中、低3個濃度的滴鼻劑。將48只200g左右的大鼠按體質(zhì)量分為正常對照（Normal）組，假手術(shù)（Sham）組，生理鹽水（NS）組，和高、中、低劑量（HhPTH，MhPTH，LhPTH）組，每組8只。對除正常對照組外其余大鼠進(jìn)行卵巢摘除手術(shù)。飼養(yǎng)2周后，高、中、低劑量組每日滴鼻相應(yīng)濃度滴鼻劑80μl，生理鹽水組每日滴鼻生理鹽水8
8、0μl。1.2.4骨密度和骨小梁厚度的
