基因相關(guān)肽的制備及其應(yīng)用的初步研究

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1、基因相關(guān)肽的制備及其應(yīng)用的初步研究摘要】目的:對(duì)hPTH(134)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,提高蛋白水解酶的穩(wěn)定性,增強(qiáng)酶活性,使之更適合制成滴鼻劑,并驗(yàn)證治療骨質(zhì)疏松癥的效果。方法:確定將hPTH(134)改造成為ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro后,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pED4PhPTH(134),轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)LysE,乳糖誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)分離純化獲得目的多肽。將目的多肽與二甲基β環(huán)糊精、聚丙烯酸、EDTA制成滴鼻劑,治療卵巢摘除大鼠(OVXedRats)的骨質(zhì)疏松癥。結(jié)

2、果:獲得純度較高的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro,將制成的滴鼻劑用于卵巢摘除大鼠,與生理鹽水滴鼻治療組相比能顯著增加大鼠椎骨骨密度(P<0.01)及股骨頭骨小梁厚度(P<0.001),對(duì)鼻黏膜沒有損傷。結(jié)論:ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro制成滴鼻劑治療卵巢摘除大鼠的骨質(zhì)疏松癥效果明顯,有進(jìn)一步開發(fā)的前景。【關(guān)鍵詞】人甲狀旁腺素滴鼻劑骨質(zhì)疏松癥骨密度骨小梁骨質(zhì)疏松癥是一種老年人和絕經(jīng)后婦女的常見疾病,容易造成骨折,降低生活自理能力。甲狀

3、旁腺素(PTH)是一種由甲狀旁腺分泌的激素,由84個(gè)氨基酸組成,是血鈣的主要調(diào)節(jié)劑之一[1]。PTH小劑量多次給藥具有明顯的成骨作用,PTH(134)則完全保留了這種活性,所以PTH(134)成為目前治療骨質(zhì)疏松的理想藥物[1142]。PTH及其相關(guān)肽類藥物都采用注射給藥,頻繁給藥給患者帶來極大的不便和痛苦。與注射劑相比滴鼻劑具有使用方便、患者依從性較好等特點(diǎn),因此開發(fā)PTH(134)的滴鼻劑具有廣闊的市場(chǎng)前景。多肽類藥物滴鼻給藥,透過鼻黏膜吸收比較困難,而且易被吸收過程中的蛋白酶所降解[3],除了從藥劑學(xué)上

4、來解決此問題,我們認(rèn)為有必要對(duì)hPTH(134)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。結(jié)構(gòu)改造有兩個(gè)目的,一方面為了增強(qiáng)其對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性,避免吸收過程中酶的降解,另一方面增強(qiáng)其活性,彌補(bǔ)多肽類藥物生物利用度較低的不足。經(jīng)過查閱文獻(xiàn),我們選定將hPTH(134)改造為ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro,采用基因工程的方法來獲得該肽,并制成滴鼻劑治療卵巢摘除大鼠的骨質(zhì)疏松癥驗(yàn)證其藥效。1材料與方法1.1材料pET28ansBC為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存,pET28a購自TaKaRa公司,大腸桿菌BL21(DE3

5、)為本實(shí)驗(yàn)室保存,CM52購自Whatman公司,二甲基β環(huán)糊精(DMβCD)購自Sigma公司,SD大鼠由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。141.2方法1.2.1ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro表達(dá)和純化通過PCR方法我們合成編碼ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的DNA片斷,并將其插入質(zhì)粒pET28ansBC的BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間得到表達(dá)質(zhì)粒pED4PhPTH(134)。在該表達(dá)質(zhì)粒中

6、,ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro是通過酸敏感位點(diǎn)AspPro連接到大腸桿菌門冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。將該質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證后,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)LysE后進(jìn)行表達(dá),然后經(jīng)包涵體洗滌,8mol·L-1尿素溶解,乙醇分級(jí)沉淀獲得融合蛋白,再經(jīng)酸水解,CM52柱層析獲得目的多肽。1.2.2ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的HPLC分析反相柱為ShimpackCLCODS6.0mmID×15cm,A相為0.1%的三氟乙酸水溶液

7、,B相為純乙腈,梯度為B相從20%到70%,洗脫時(shí)間為20min,流速為1ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm,進(jìn)樣量為20μl,溫度為室溫。1.2.3ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro滴鼻劑的制備及對(duì)卵巢摘除大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療將不同質(zhì)量濃度的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro(2.500、1.250和0.625mg·ml-1)、DMβCD(40mg·ml-1)、聚丙烯酸(2.5mg·ml-1)及EDTA14Na(0.1mg·ml-1)溶解到生

8、理鹽水中,調(diào)pH6.0,配制成高、中、低3個(gè)濃度的滴鼻劑。將48只200g左右的大鼠按體質(zhì)量分為正常對(duì)照(Normal)組,假手術(shù)(Sham)組,生理鹽水(NS)組,和高、中、低劑量(HhPTH,MhPTH,LhPTH)組,每組8只。對(duì)除正常對(duì)照組外其余大鼠進(jìn)行卵巢摘除手術(shù)。飼養(yǎng)2周后,高、中、低劑量組每日滴鼻相應(yīng)濃度滴鼻劑80μl,生理鹽水組

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