原子力顯微鏡對星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤的鑒別診斷

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1、原子力顯微鏡對星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤的鑒別診斷：張佳怡紀(jì)小龍王美娥【摘要】目的通過原子力顯微鏡（AFM）觀察星形細胞瘤(II/并對每例的10個細胞進行掃描，對每個細胞膜表面1μm區(qū)域的平均粗糙度、峰值、表面積差值進行測量，對比觀察兩組細胞膜表面的納米結(jié)構(gòu)變化、找出腫瘤細胞特異性的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果通過觀察發(fā)現(xiàn)星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤的細胞膜表面存在著顯著的差異，星形細胞瘤細胞膜表面的平均粗糙度、峰值、表面積差值均明顯低于間變性星形細胞瘤(P<0.05)。結(jié)論本實驗應(yīng)用AFM對星形細胞瘤細胞、間變性星形細胞瘤細胞進行觀察，并依據(jù)細胞膜表面數(shù)據(jù)對星形

2、細胞瘤、間變性星形細胞瘤進行鑒別診斷?！娟P(guān)鍵詞】原子力顯微鏡星形細胞瘤間變性星形細胞瘤膜蛋白原子力顯微鏡（atomicforcemicroscope,AFM）[1]是具有原子級分辨率的新一代顯微鏡，可以在常規(guī)生理環(huán)境中清晰呈現(xiàn)出細胞膜表面的超微結(jié)構(gòu)并進行數(shù)據(jù)分析。AFM的出現(xiàn)對膜蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識提供了更廣的空間，蛋白質(zhì)分子在脂質(zhì)上有規(guī)律地排列或者能在膜上形成二維晶體，均適合于應(yīng)用AFM研究[2，3]，使人們對生命的認(rèn)識開始深入到了納米級水平上的超微觀領(lǐng)域?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[4-6]：腫瘤細胞膜表面受體蛋白與細胞外部生長因子（或其它刺激因素）結(jié)合后的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在

3、腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。細胞外部信號無論是作用于細胞核內(nèi)還是核外，它們的傳遞都必須經(jīng)由細胞膜，并與細胞膜表面的特異性受體（蛋白）結(jié)合，然后傳遞至細胞內(nèi)而發(fā)揮作用。一旦細胞表面受體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)異常，則其持續(xù)的激活狀態(tài)將導(dǎo)致細胞增殖失控，從而促進腫瘤的發(fā)生。腫瘤細胞的生長過程必然伴有細胞膜表面蛋白（數(shù)量和形態(tài)）的改變。采用AFM對星形細胞瘤細胞和間變性星形細胞瘤細胞進行觀察，研究二者細胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的差異，為其臨床的鑒別診斷提供依據(jù)。1材料與方法1.1材料和設(shè)備標(biāo)本全部經(jīng)HE染色確定為星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤的新鮮組織細胞，于武警總醫(yī)院。各30例；

4、2％甲醛溶液、蘇木素—伊紅染液、巴氏染液、酒精、二甲苯。主要設(shè)備：原子力顯微鏡(型號為NanoscopeⅢa(DigitalInstrumentsInc.,SantaBarbara,CA)，采用NSC—11型針尖；OlympusBX50光學(xué)顯微鏡；顯微圖像分析系統(tǒng)；超凈工作臺；離心機、漩渦混合器。1.2方法1.2.1分別用刮板在收集到的星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤組織上進行取樣，并將采集了瘤細胞的刮板放入裝有2％甲醛溶液的試管中，在試管上做好標(biāo)記，搖蕩刮板使細胞標(biāo)本洗脫在溶液中，去除刮板后固定20min，用200目鋼網(wǎng)過濾，去除組織殘塊和細胞團，放入離心機，1

5、500r／min離心15min，緩緩傾去上清液，再用2％甲醛溶液洗滌、離心、棄上清液反復(fù)3次，加少許2％甲醛溶液將沉淀的細胞用漩渦混勻器混勻，將細胞懸液涂于潔凈的載玻片上，置于潔凈空間晾干備用。1.2.2AFM觀測將樣本晾干后置于AFM載物臺上，利用Nikon倒置顯微鏡觀察細胞的分散情況，選擇細胞分散較好的區(qū)域進行掃描。最大掃描范圍100μm，用200μm長的Si3N4微懸臂，采用輕敲模式（Tappingmode）,圖像采集為恒力模式（Heightmode）。調(diào)整激光與針尖重合，并將探測器的激光光斑置于中心圓點。在操作軟件下進行自動調(diào)頻，然后下降探針，直至針尖

6、接觸到樣本，開始掃描。此時計算機顯示該細胞相應(yīng)的圖像，此圖像可以進行測量和保存。每例樣本掃描10個細胞，掃描范圍為500nm～100μm,掃描頻率為0.5～2Hz。選細胞膜表面顏色最亮、突起最大最密集的區(qū)域測量，所選細胞測量范圍均為1μm，每一組各測量300個區(qū)域。并利用AFM圖象分析軟件對每個1μm區(qū)域的平均粗糙度、峰值、表面積差值進行分析。并獲取3種參數(shù)的具體測量值，采用SPSS13.0軟件對這而種細胞的3種參數(shù)值進行方差分析,比較細胞間是否有差別。2結(jié)果2.1細胞形態(tài)觀察結(jié)果星形細胞瘤細胞表面呈現(xiàn)層狀排列的皺褶結(jié)構(gòu)，胞體間見大量粗細不一的胞突，有時難以分

7、辨它們的所屬細胞。間變性星形細胞瘤細胞密度大，胞膜表達不光滑皺褶結(jié)構(gòu)更為明顯，瘤細胞胞突少，長短不一，但主要為較短小突起。2.2細胞膜AFM下納米水平表現(xiàn)利用AFM的圖像分析軟件系統(tǒng)對星形細胞瘤細胞、間變性星形細胞瘤細胞細胞膜表面重要指標(biāo)即平均粗糙度（meanroughness）、峰值（peakcount）和表面積差值（surfaceareadifference）進行測量與分析（如表1）。與星形細胞瘤細胞比較，間變性星形細胞瘤細胞的平均粗糙度升高，峰值增加，表面積差值變大，具有顯著性差異(P<0.05)（如圖1、2）。因此可通過這三者的差異對星形細胞瘤和

8、間變性星形細胞瘤進行鑒別診斷。表1細胞