綿羊卵巢組織石蠟切片

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1、綿羊卵巢組織石蠟切片制作條件優(yōu)化研究姜曉龍陳建偉姚曉磊趙妙妙呂麗華(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院山西太谷030801)【摘要]為觀察綿羊正常卵巢組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用蘇術(shù)精一伊紅(hcmatoxylirrcosin,HE)染色法制作綿羊卵巢組織石蠟切片。結(jié)果顯示，在切片制作過程中存在的問題主要包括染色不均、染色對比不明顯、過度染色、染色過淺和切片出現(xiàn)斑點(diǎn)等。在試驗(yàn)過程中可通過充分分化、藍(lán)化、充分水洗等因素的控制來提高切片的染色效果，該方法可為動物卵巢及卵泡染色切片制作提供技術(shù)指導(dǎo)。關(guān)鍵詞:綿羊;HF染色;卵巢;切片;優(yōu)化HF染色法是石蠟切片技術(shù)中常

2、用的染色法。蘇術(shù)精堿性染液可使細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)核糖體著藍(lán)紫色;伊紅酸性染料可使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色，作為組織學(xué)、月王胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基木的技術(shù)方法而被]’一泛使用川。木試驗(yàn)通過HF染色技術(shù)制作石蠟切片，該方法是一種多步驟、多因素決定的過程，在試驗(yàn)中由于操作不當(dāng)，經(jīng)驗(yàn)不足，以及實(shí)踐的使用和時(shí)間的掌握等諸多因素影響，出現(xiàn)切片脫落、染色不均勻、糊不清、褶皺，及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對比不明顯等現(xiàn)象，從而影響使用效果。HF染色切片制作過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行了探究，并提出解決方案，這對相關(guān)的試驗(yàn)操作具有指導(dǎo)意義。1材料與方法1.1試驗(yàn)

3、材料木試驗(yàn)選用山西省清徐縣屠宰場成年健康母羊，屠宰后取卵巢。1.2主要試劑和儀器Youin氏固定液、包埋紙盒、染色缸、融蠟箱、切片機(jī)、恒溫箱、載玻片、小燒杯、吸水紙、移液槍、蓋玻片、石蠟，1%鹽酸水溶液、0.500伊紅(水溶性)溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、蘇術(shù)精染液、伊紅染液、中性樹膠、蒸餾水。1.3試驗(yàn)方法1.3.1綿羊卵巢的處理:將卵巢投入預(yù)先配好的固定液中(1000福爾馬林，Youin氏固定液等)，使組織蛋白質(zhì)變性并防II幾細(xì)胞死亡后自溶或細(xì)菌分解。1.3.2脫水透明:用低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織中的水分，再將組織塊置于二

4、甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊中的酒精，才能浸蠟包埋。1.3.3浸蠟包埋:將透明處理的組織塊置于熔化的石蠟中，放入熔蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。1.3.通切片與貼片:將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成厚度為}^-8pm薄片。切卜的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放朽。C恒溫箱中烘干川。1.3.脫蠟染色:染色前，用二甲苯門)脫蠟5min，入二甲苯Ul}中脫蠟10min，用吸水紙吸干液體;入100%乙醇U)smin，入100%乙醇門1)5min，用吸水紙吸干液體;入9500乙醇3min并過流水2min，用吸水紙

5、吸干水分。蘇術(shù)精染色}^-8min，并用1%鹽酸水溶液分化5}-10s，自來水洗返藍(lán)15^-30min;0.500伊紅(水溶性)染色30s,95%乙醇門脫水5min，用吸水紙吸干液體;95%乙醇門1)脫水5mln，用吸水紙吸干液體;入100%乙醇門}6min,100%乙醇}ll}2min,用吸水紙吸干液體入二甲苯<1)中透明2^-3min，二甲苯Cll)中透明5min。用移液槍吸取適量中性樹膠于載玻片上，蓋上蓋玻片待凝固后觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1正常染色經(jīng)顯微鏡觀察，正常HF染色切片見圖1-A,l-B。圖1-A可見卵巢上有腔卵泡的存在，圖

6、1-B可見卵巢卵泡顆粒細(xì)胞(GCS、內(nèi)膜細(xì)胞CTC)的細(xì)胞核呈藍(lán)紫色;而周圍的細(xì)胞質(zhì)、纖維被染成粉紅色，切片染色均勻無褶皺，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對比明顯。2.2染色異常在切片制作尤其是染色過程中常會出現(xiàn)染色異常情況，從而影響了正常的組織形態(tài)觀察。圖1-C顯示細(xì)胞核染色蒼白、暗淡，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比度差。出現(xiàn)這類問題有三種原因:切片在蘇術(shù)精染液停留時(shí)間太短;蘇術(shù)精染液過度氧化，失去染色能力;分化步驟處理時(shí)間過長?？蛇M(jìn)行切片重新染色。如果組織在酸性固定液Zcnkcr,Bouin及非中性緩沖甲醛液固定時(shí)間過長，細(xì)胞核染色能力將減弱，須增加其在蘇術(shù)精染

7、色液的時(shí)間，或用一些方法增加組織的嗜堿性，以改善細(xì)胞核的著色。圖1-I}顯示細(xì)胞核過染，核膜、核仁等不清晰，細(xì)胞質(zhì)含有大量的蘇術(shù)精，導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)。這主要是由于在染色過程中切片在蘇術(shù)精染液停留過長、切片太厚、分化步驟時(shí)間太短，造成蘇術(shù)精染液大量分布而占據(jù)細(xì)胞質(zhì)位置。通過顯微鏡上卜微調(diào)觀察，如果只有1}-2層細(xì)胞核層次，說明不是因?yàn)榍衅?，可?jīng)脫色、漂白、重新染色，對染色和分化時(shí)間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。若是由于切片太厚導(dǎo)致的細(xì)胞核過染，則需要重新切片。圖1-F顯示細(xì)胞核呈紅、棕色改變。這主要由于蘇術(shù)精染色液過度氧化和切片在蘇術(shù)精染液染色

8、后返藍(lán)不足。提示染色之前檢查蘇術(shù)精染色液的染色能力，發(fā)現(xiàn)氧化過度應(yīng)及時(shí)更換;同時(shí)，可用流水、溫水或弱堿性溶液如稀氨水、0.200碳酸氫鈉溶液等在蘇術(shù)精染色后，給切片