組織石蠟切片制作

《組織石蠟切片制作》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、組織石蠟切片制作（一）組織固定包埋切片1用途2主要設(shè)備3藥品及溶液配制4具體步驟及注意事項5出現(xiàn)問題及解決1用途（1）用于各種組織結(jié)構(gòu)分析（化學(xué)染料）H.E.染色;PAS染色；苯胺藍(lán)染色；油紅O染色；茜素紅染色；等等（2）用于組織中特定蛋白質(zhì)的定位表達(dá)分析免疫組化；免疫熒光（3）用于組織中特定基因mRNA的定位表達(dá)分析原位雜交；熒光原位雜交2主要設(shè)備?1瓷盤；刀片；記號筆；通風(fēng)櫥；?2石蠟；電爐；酒精燈；玻璃吸管；紙槽（需要提前折疊好）；大平皿；染色缸；吸水紙；鑷子（至少2把）?3切片用刀片；毛筆；玻片盒；切片機(jī)；預(yù)處理的玻片；展片5

2、2度恒溫水；吸水紙；鉛筆；恒溫箱實驗前準(zhǔn)備?思想上重視，考慮到每一步都不能出錯。?時間上準(zhǔn)備，充足的時間做實驗。?技術(shù)上準(zhǔn)備，考慮材料的特點對各個步驟的改進(jìn)，生搬硬套其它組織的過程會出問題。?實驗條件的準(zhǔn)備，設(shè)備和藥品，溶液配制等等是否齊備。4具體步驟及注意事項4.1取材?根據(jù)不同的目的、組織特征代表性取材。?取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。每個組織最好多取幾塊。?取材時要注明取材時間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數(shù)量、所取組織位于器官的部位等，以備查。4.2固定固定劑的

3、作用對象主要是蛋白質(zhì)（一）固定劑：1．甲醛：10%甲醛福爾馬林100ml;蒸餾水900ml注：實際甲醛含量只有3.6~4.0%但習(xí)慣上都將其視為10%。2．10％中性福爾馬林鈣固定液甲醛液10ml;蒸餾水90ml加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后，放置24小時取上清液使用。?3．4%多聚甲醛?先配制8%多聚甲醛:?多聚甲醛8g;蒸餾水100ml加溫至60℃左右，不時攪拌，成為乳白色溶液。滴加1NNaOH，并不停攪動至液體清明。?再取8%多聚甲醛50ml，用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將P

4、H值調(diào)至7.2?PH=7.2的PBS緩沖液50ml?4．Bouin液：苦味酸飽和水溶液75ml36％~40％福爾馬林液25ml冰醋酸5m15．改良Bouin氏固定液苦味酸飽和水溶液45ml95%酒精45ml36％~40％福爾馬林液5ml冰醋酸5m1?固定時，須注意以下幾點：（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。（2）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長。（3）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。PAF應(yīng)

5、放在4度。3．水洗?目的：洗去滲入組織中的固定液，終止固定。以免影響對組織內(nèi)結(jié)構(gòu)的觀察、分析和研究。（1）各種以水配制的固定液如甲醛，都必須用流水沖洗，大塊組織一般沖洗24小時，小塊組織一般沖洗2—10小時。（2）固定液為多聚甲醛時，用于免疫組織化學(xué)等特殊染色的應(yīng)將組織投入PB緩沖液中，每60分鐘更新洗滌液一次，累計6小時。（3）經(jīng)含有苦味酸的固定液固定的組織塊，無論其固定液是水溶性還是酒精溶性，都應(yīng)充分沖洗，水溶性固定液固定的組織塊一般須沖洗12小時，再進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌，酒精溶性固定液固定的組織塊直接進(jìn)入70%的酒精溶液洗滌

6、，該溶液可以脫掉苦味酸的黃色，但最好從50%酒精開始洗滌。（4）固定液為酒精或是酒精混合液，一般不需用水沖洗，其組織塊的洗滌應(yīng)用與固定液濃度相等垢酒精換洗或者直接進(jìn)行脫水的程序。3．脫水及透明?3.1脫水的目的組織內(nèi)的水不能和支持劑混合，所以必須把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟，有利于組織的永久保存。?3.2乙醇可作固定劑，又可脫水劑，但乙醇與水混合時有較劇烈的物理反應(yīng)。高濃度的酒精對組織有強(qiáng)烈收縮及脆化的缺點，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過由高到低的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證

7、組織脫水徹底，并避免組織過度收縮和硬化。?3.3乙醇脫水過程50%乙醇6~8小時-75%乙醇6~8小時-85%乙醇3~5小時-95%乙醇1~2小時-95%乙醇1~2小時-100%乙醇Ⅰ1小時-100%乙醇Ⅱ1小時?3.4脫水注意事項：（1）脫水的過程應(yīng)逐步地而不應(yīng)驟然地進(jìn)行，不能操之過急。（2）脫水的時間應(yīng)根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。（3）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內(nèi)不能放置的時間太長。無水乙醇吸水能力太強(qiáng)，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片理組織易碎裂。（4）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。（5）每

8、次更換新的脫水劑時（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，裝組織塊的容器也要控干水分，以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。（6）脫水劑的先擇要根據(jù)實驗的要求及實驗室的條件。?3.5透