天然高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析論文

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1、天然高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析論文張迎光，施曉聰，林全思，王震，呂建新【摘要】目的：從環(huán)境中分離高產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：從天然高油脂含量土壤篩選高產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌，鑒定菌種后，設(shè)計相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增脂肪酶基因并進(jìn)行TA克隆.freelenvironment，andcloneitslipasegene.Methods:HighactivitieslipaseproducingbacteriasoilplifiedlipasegeneidedintoE.ColiDH5αtobuildtheengineeringbacteria.

2、Atlast，thelipasegeneplifiedbyPCR，thenseparatedandidentifiedasaneutantlipasegenebyrestrictionendonucleasedigestingandsequencing.standardlipasegeneregisteredonNCBI(EU310372)，Thesecondarystructureoftheneutantlipasegeneoredifferentfromstandardlipase.Conclusion:Astrainofhighactivitiesli

3、paseproducingbacteria-Staphylococcusaureusissuccessfullyisolatedandtheclonedlipasegeneisaneutanttype.KeyidPurificationKitVer.2.0）、基因組提取試劑盒，均購自寶生物工程有限公司；橄欖油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫購自上海三愛思試劑有限公司。1.2產(chǎn)脂肪酶天然菌株的篩選及鑒定產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌主要從自然界中篩選，采集溫州汽車站，茶山鎮(zhèn)及溫州醫(yī)學(xué)院茶山校區(qū)周圍的油污豐富的土壤，供分離使用。共采集到土壤樣品14份(包括:河道污泥、餐廳廚房清洗處

4、污泥、菜市場肉案上木屑、修車店門前污泥、飲食店油煙機(jī)油漬等)。篩選方法是：樣品經(jīng)富集培養(yǎng)、平板初篩(觀察變色圈大小)，最后經(jīng)搖瓶復(fù)篩(測酶活力大小)，具體的配方及操作參照文獻(xiàn)9。將分離到的菌株用法國梅里埃微生物鑒定儀鑒定，然后進(jìn)行酶活測定。1.3天然菌基因組提取的優(yōu)化運(yùn)用了試劑盒法、酚-氯仿法、煮沸法三種方法分別提取金黃色葡萄球菌全基因組，并經(jīng)PCR擴(kuò)增脂肪酶基因10，比較三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定的基礎(chǔ)。1.4脂肪酶基因的克隆根據(jù)NCBI上公布的一些常見的細(xì)菌脂肪酶基因設(shè)計了8對通用引物（見表1）。用8對引物分別對分離出的菌株進(jìn)行脂肪酶基因的擴(kuò)增

5、。PCR反應(yīng)條件I為：94℃預(yù)變性5min，再循環(huán)30次：94℃變性55s，58℃退火50s，72℃延伸150s，最后1個循環(huán)72℃延伸10min，適用于引物3、5、8的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件II為：94℃預(yù)變性5min，再循環(huán)30次：94℃變性55s，58℃退火50s，72℃延伸1min，最后1個循環(huán)72℃延伸10min，適用于引物1、2、4、6、7的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL體系。PCR產(chǎn)物用經(jīng)試劑盒純化，用T4連接酶于與pMD18-TVector，16℃連接2h后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α細(xì)菌，再將少許菌液涂布在含有X-Gal，IPTG，Amp

6、的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選驗(yàn)證試驗(yàn)。1.5pMD18-TVector重組載體鑒定挑取上步驟中單個白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒11，雙酶切電泳鑒定。同時將單個白色菌落的菌液送上海生工測序。1.6脂肪酶測序分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析運(yùn)用軟件CodonCodeAligner分析測序結(jié)果，SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對其進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過在線軟件PredictProtein分別對人工分離到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注冊號EU310372脂肪酶進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析12。2結(jié)果2.1產(chǎn)脂肪酶天然菌株的篩選經(jīng)過初篩、復(fù)篩培養(yǎng)，分離出4株活性較高菌株，經(jīng)過法國梅里埃

7、微生物鑒定儀鑒定，2株為霉菌，1株為適應(yīng)弱堿性環(huán)境的金黃色葡萄球菌（見圖1A，1B），1株為蠟樣芽孢桿菌。經(jīng)過富集、初篩、復(fù)篩等過程，用溴甲酚紫平板從富含油脂的土壤中篩選得到產(chǎn)脂肪酶的菌株，大部分酶活力經(jīng)測定后在20U/mL以內(nèi)（見表2）。并對其中的4株的酶學(xué)特性做了初步研究，4株的作用溫度都較高，在42℃左右，一株為產(chǎn)弱堿性脂肪酶，另3株為產(chǎn)弱酸性脂肪酶。2.2天然菌基因組提取的優(yōu)化所提供的三種提取方法提取全基因，提取效果見圖2。泳道1和3試劑盒法、酚-氯仿法所提取DNA電泳條帶清晰，泳道2煮沸法提取DNA電泳條帶幾不可見，表明試劑盒法、酚-氯仿法方法提取

8、的DNA得率較高，煮沸法提取的DNA得率較低。2.2