天然高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析【論文】

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1、天然高產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的分離鑒定及脂肪酶基因的分析作者：小小小作者：張迎光，施曉聰，林全思，王震，呂建新【摘要】目的:從環(huán)境中分離高產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：從犬然高油脂含量土壤篩選高產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌，鑒定菌種后，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增脂肪酶基因并進(jìn)行TA克隆，重組載體轉(zhuǎn)入E.coliDH5a構(gòu)建工程菌，雙酶切及測(cè)序鑒定脂肪酶基因。結(jié)果：經(jīng)過(guò)微生物菌種鑒定獲得4株高活力菌，其中一株金葡菌產(chǎn)酶最高，利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增脂肪酶基因，該基因經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序及其雙酶切鑒定證實(shí)為新發(fā)現(xiàn)的突變脂肪酶基因，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)基因(EU310372)有較大不同。結(jié)論：成功分離一株高產(chǎn)脂肪

2、酶的菌株——金黃色葡萄球菌，克隆的脂肪酶基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變型?！娟P(guān)鍵詞】脂肪酶基因；PCR；TA克隆Abstract:Objcctivc:Toseparatcnaturalbactcriaproducinghighactivitieslipasefromenvironment,eindcloneitslipasegene.Methods:Highactivitieslipaseproducingbacteriawasscreenedfromsoilwhichcontainedplentyofoilsandfats.Afteridentifyingbacteria,PCRampl

3、ifiedlipasegenewhichwasclonedtopMD18~TVector.TherecombintplasmidwastransformedintoE.ColiDH5atobuiIdtheengineeringbacteria.Atlast,the1ipasegenewasidentifiedwithtworestrietionendonuclcascdigestingandsequencing.Results:Afteridentifiying,4producinghighactiviticlipasesbacteriastrainswereobtained,

4、oneofwhichwasaStaphylococcusaureusproducinghighestactivitieslipase,itslipasegenewasamplifiedbyPCR,thenseparatedandidentifiedasanewmutantlipasegenebyrestrictionendonucleasedigestingandsequencing,standard1ipasegeneregisteredonNCBT(EU310372),Thesecondarystructureofthenewmutant1ipasegenewasmored

5、ifferentfromstandardlipase.Conclusion:Astrainofhighactivitieslipaseproducingbactcrio-Staphylococcusaureusissuccessfullyisolatedandtheclonedlipasegeneisanewdiscoveredmutanttype.Keywords:lipasegene；PCR；TAcloning脂肪酶是一類(lèi)酯鍵水解酶，廣泛存在于微主物、植物種子及動(dòng)物組織中，能在油水界面上催化脂類(lèi)物質(zhì)分解、合成和酯交換反應(yīng)。作為重要的工業(yè)用酶，脂肪酶在醫(yī)藥、食品、制革、飼料、

6、洗滌、油酯化工等傳統(tǒng)工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如可添加在洗滌劑增加去汕脂能力，添加在高脂食物以增加口感，而近年來(lái)其在生物能源、有機(jī)合成、藥物手性拆分和工具酶等新領(lǐng)域也展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景［1］。以上領(lǐng)域應(yīng)用的脂肪酶，或?yàn)樘烊痪蛛x或?yàn)榛蛑亟M來(lái)源，但其微生物來(lái)源脂肪酶應(yīng)用最廣泛［2-5］o據(jù)統(tǒng)計(jì)，細(xì)菌冇28個(gè)屈，放線(xiàn)菌冇4個(gè)屈，酵母菌冇10個(gè)屈，其他真菌冇23個(gè)屈，共計(jì)達(dá)65個(gè)屈的微牛物產(chǎn)脂肪酶。而動(dòng)物脂肪酶、植物脂肪酶由于其作用底物譜窄，體外表達(dá)活性、產(chǎn)量低，該類(lèi)基因很少作為基因工程的脂肪酶來(lái)源基因［6-8］o木課題擬通過(guò)從高含油脂的環(huán)境屮分離到產(chǎn)高活力脂肪酶的微生物并克隆高活

7、力脂肪酶基因，為后續(xù)的獲得工程菌清除高油脂污水、獲得較高活力脂肪酶基因并通過(guò)基因工程獲得高活力、高產(chǎn)量的重組脂肪酶研究打下一定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1主要試劑E.coliDH5a由溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；限制性?xún)?nèi)切酶Ndel,HindIII,Ncol,Xhol,pMD-18Tvector,T4連接酶、TagDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0）、基因組提取試劑盒,均購(gòu)自寶生物工程有