孕婦外周血胎兒有核紅細(xì)胞在產(chǎn)前診斷中的作用

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1、目前對遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷有數(shù)種方法。根據(jù)采樣途徑或診斷方法是否構(gòu)成對胎兒的影響可分為侵入性產(chǎn)前診斷和非侵入性產(chǎn)前診斷。前者包括羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛細(xì)胞吸取術(shù)及胎兒臍血穿刺等，雖然診斷精確度較高，但可導(dǎo)致流產(chǎn)等并發(fā)癥，只能在高危孕婦中實(shí)施;后者的優(yōu)點(diǎn)是既能行產(chǎn)前診斷又無危險(xiǎn)性，適用于低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦大群體篩選，盡早發(fā)現(xiàn)和杜絕異常胎兒，達(dá)到優(yōu)生目的。許多學(xué)者致力于利用胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷。利用孕婦外周血的胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷三個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)為:（1）證實(shí)母血中存在胎兒細(xì)胞和DNA。（2）建立可靠穩(wěn)定的方法分離胎兒細(xì)胞和DNA。（3）應(yīng)用靈敏性、特

2、異性強(qiáng)的技術(shù)以微量胎兒細(xì)胞和DNA為模板診斷遺傳性疾病。這是最具潛力的非侵入性產(chǎn)前診斷方法之一?！　?孕婦外周血中胎兒細(xì)胞　　正常胎盤并非是完善的、細(xì)胞透不過的屏障。在人類正常妊娠當(dāng)中，進(jìn)入母體血液循環(huán)中的胎兒血量估計(jì)是0.1～0.3ml。孕婦血中胎兒細(xì)胞的主要類型包括滋養(yǎng)葉細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞（NRBC）等［1］。其中最合適做產(chǎn)前診斷的胎兒細(xì)胞類型當(dāng)首推胎兒有核紅細(xì)胞，理由是:（1）胎兒有核紅細(xì)胞是單核的，孕早期胎兒血中含量豐富但孕婦外周血中罕見;（2）其表達(dá)幾種特異的抗原如運(yùn)鐵蛋白受體和特異的胎兒血紅蛋白肽鏈如α

3、鏈、β鏈和γ鏈，作為細(xì)胞標(biāo)記而利于細(xì)胞的分類、鑒定和聚集;（3）其在孕婦外周血中的生存期短，不會持續(xù)到下一次妊娠［2］?！　√河泻思t細(xì)胞在早孕時(shí)就在母體血中出現(xiàn)，隨著妊娠的進(jìn)展而有所變化。在不同階段，在母體血中所能檢出胎兒有核紅細(xì)胞的量亦不同。陳漢平等運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對61例孕11～34周，21～35歲的孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在早、中、晚期妊娠時(shí)母血中都存在NRBC，孕早期NRBC含量隨妊娠的進(jìn)展呈上升趨勢，17、18周左右達(dá)高峰，此后成下降趨勢。并提出孕17、18周左右為產(chǎn)前診斷的最佳時(shí)間［3］。在分娩后2個(gè)月即不能檢出

4、，其中大部分在產(chǎn)后2h就不能測出，這表明檢測過程較少受到上次妊娠遺留的胎兒DNA的假陽性的影響［4］?！　i等應(yīng)用PCR法擴(kuò)增了17例孕婦外周血中的單拷貝Y染色體DNA序列，在所有懷有男性胎兒的7例孕婦中，均檢測出Y染色體特異性DNA序列。并證實(shí)最早的檢出時(shí)間為37天，而且在第7周檢測出80%，在第9周檢測出100%。也對其他31例孕婦在她們進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷之前行外周血Y染色體SRY基因檢測，13例懷有男性胎兒的孕婦外周血中均檢測出Y染色體SRY基因，而在18例懷有女性胎兒的孕婦外周血中均未檢出［5］?！　?孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞的

5、富集及遺傳物質(zhì)的提取　　孕婦血有核紅細(xì)胞（NRBC）含量極少，大約每1ml母血中只含5～20個(gè)胎兒細(xì)胞，NRBC更少，為每1ml含2～6個(gè)［1］胎兒細(xì)胞，必須進(jìn)行分離純化才能利于進(jìn)一步分析，做產(chǎn)前診斷?！　∧壳?，分離胎兒細(xì)胞有多種手段，主要包括密度梯度離心、磁激活細(xì)胞分類（MACS）、熒光激活細(xì)胞分類（FACS）、選擇性細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、尼龍毛柱分離法、單獨(dú)溶解紅細(xì)胞法等。其中密度梯度離心法是根據(jù)母血細(xì)胞與胎兒細(xì)胞的體積和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等存在較大差異而推測出它們的密度也可能存在較大差異而設(shè)計(jì)的［6］。張振洪等10例孕婦外周血采用密度梯度離心法富集胎兒

6、細(xì)胞，在性別為男性的6例中，SRY基因絕大部分是在中層細(xì)胞中擴(kuò)增出來的，這提示母血中胎兒細(xì)胞大部分集中在密度梯度離心后的中層細(xì)胞里。密度梯度離心法分離出來的細(xì)胞丟失少、形態(tài)完整，但是富集的胎兒細(xì)胞純度與產(chǎn)量均不夠。還應(yīng)改進(jìn)技術(shù)如采用多重密度梯度離心以提高純度［7］。熒光激活細(xì)胞分類（FACS）法也是較常用的，分選CD71+細(xì)胞，富集的胎兒細(xì)胞純度與產(chǎn)量均較高，但操作步驟復(fù)雜可能導(dǎo)致細(xì)胞丟失;CD71并非專一與NRBC結(jié)合，CD71+細(xì)胞不一定是NRBC;而且所選NRBC形態(tài)略有改變，細(xì)胞膜欠完整，也會給產(chǎn)前診斷技術(shù)帶來困難［8］。磁激活細(xì)胞

7、分類（MACS）也是可行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是在較短時(shí)間里獲得較多的靶細(xì)胞，且分離后的細(xì)胞仍有活性，可供培養(yǎng)和流式細(xì)胞分析等。Holzgreve等利用MACS對100例孕20周左右的孕婦的外周血進(jìn)行富集分離，而后進(jìn)行染色體分析，檢測出10例非整倍體的胎兒，而后進(jìn)行羊水穿刺染色體分析，符合率為100%［9］?！　√杭?xì)胞分離后應(yīng)提取胎兒遺傳物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳病的基因診斷。Lo等首次應(yīng)用煮沸法提取DNA，用PCR擴(kuò)增胎兒特異性Y序列，通過電泳檢測［10］。Houfflin等比較了單純煮沸法和加用酚/氯仿的方法提取胎兒DNA，發(fā)現(xiàn)后者可以提高提

8、取胎兒DNA的濃度，敏感性由50%提高到80%［11］。陳小蔓等后來應(yīng)用酚提取法純化孕婦血漿及血清胎兒游離DNA，證實(shí)了Houfflin等的結(jié)論［12］。Sekizawa等首次用