用孕婦外周血胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展

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1、用孕婦外周血胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科H前對(duì)遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷有數(shù)種方法。根據(jù)采樣途徑或診斷方法是否構(gòu)成對(duì)胎兒的影響可分為侵入性產(chǎn)前診斷和非侵入性產(chǎn)前診斷。前者包括羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛細(xì)胞吸取術(shù)及胎兒臍血穿刺等，雖然診斷精確度較高，但易導(dǎo)致流產(chǎn)等并發(fā)癥，只能在高危孕婦小實(shí)施；后者的優(yōu)點(diǎn)是既能行產(chǎn)前診斷又無危險(xiǎn)性，適用于低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦大群體篩選，盡早發(fā)現(xiàn)和杜絕界常胎兒，達(dá)到優(yōu)牛目的。利用孕婦外周血的胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷即是最具潛力的非侵入性產(chǎn)前診斷方法之一，近年來研究十分活躍，臨床醫(yī)師應(yīng)注意這一領(lǐng)

2、域的進(jìn)展。＞一、孕婦外周血胎兒細(xì)胞的類型1893年已證明孕婦的肺循環(huán)屮有滋養(yǎng)葉細(xì)胞存在，以后陸續(xù)有報(bào)道孕婦外周血中其他類型的胎兒細(xì)胞的存在。孕婦血中胎兒細(xì)胞的主要類型包括滋養(yǎng)葉細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、冇核紅細(xì)胞（NRBC）等。直到1969年才考慮到將孕婦血中胎兒細(xì)胞作為產(chǎn)前遺傳病診斷的材料［1］。滋養(yǎng)葉細(xì)胞雖因其形態(tài)大易于鑒別，但在早孕母血中含量極少且迅速陷于肺組織中更使其在孕婦周圍血含量更微，再者具所含染色體并非總是與胎兒相符，是因其多核特點(diǎn)及具與胎盤的嵌合現(xiàn)象所致，所以滋養(yǎng)葉細(xì)胞不是理想的產(chǎn)前診斷細(xì)胞。胎兒淋巴細(xì)胞

3、用作產(chǎn)前診斷冇相當(dāng)?shù)臐撠疛,因其表達(dá)HLA抗原，故當(dāng)父母的HLA不同時(shí)，更易分離、鑒別與富集，但當(dāng)父母HLA相同吋則無特界性的鑒別與分類、富集方法；但胎兒淋巴細(xì)胞產(chǎn)生太遲（孕中期），失去早期診斷意義；另外胎兒淋巴細(xì)胞在孕婦血中牛存期長，達(dá)數(shù)年或更長，易造成誤診（多次妊娠者），因此胎兒淋巴細(xì)胞也不是最理想的產(chǎn)前診斷材料。其他的白細(xì)胞如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等研究得不多，特異性也不高。目前認(rèn)為最合適作產(chǎn)前診斷的胎兒細(xì)胞類型當(dāng)首推胎兒有核紅細(xì)胞，理由是：（1）胎兒有核紅細(xì)胞是單核的，孕早期胎兒血屮含雖豐富但孕婦外周血中罕見；（2）其表達(dá)幾種

4、特界的抗原如運(yùn)鐵蛋白受體和特異的胎兒血紅蛋白肽鏈如匚鏈和Y鏈，作為細(xì)胞標(biāo)記而利于細(xì)胞的分類、鑒定和富集；（3）其在孕婦外周血中的牛存期短，不會(huì)持續(xù)到卜?一次妊娠。但值得注意的是早孕期孕婦外周血的有核紅細(xì)胞大都是孕婦本身產(chǎn)生的［2,3］。＞二、胎兒細(xì)胞的富集、鑒別及分析技術(shù)由于孕婦血屮胎兒細(xì)胞的數(shù)量太少，人約是孕母血細(xì)胞的1/105?1/109［4］,必須進(jìn)行分離純化才能利于進(jìn)一步分析、作產(chǎn)前診斷。目前，分離胎兒細(xì)胞有多種手段，主要包括密度梯度離心、流式細(xì)胞分類計(jì)、磁激活細(xì)胞分類（MACS）、熒光激活細(xì)胞分類（FACS）＞選擇性細(xì)

5、胞培養(yǎng)技術(shù)、尼龍毛柱分離法、單獨(dú)溶解紅細(xì)胞法等。Johansen等［5］分別采用5種不同的方法對(duì)滋養(yǎng)葉細(xì)胞進(jìn)行分離的研究表明，單獨(dú)溶解紅細(xì)胞法是獲得滋養(yǎng)葉細(xì)胞的最好途徑，當(dāng)與Ficoll密度梯度離心法聯(lián)用時(shí)則獲得的純度低且費(fèi)時(shí)。FACS盡管富集力強(qiáng)（3250倍）且純度高，但收獲率低?%）。外包裹有抗CD16抗體的免疫滋珠法是進(jìn)行滋養(yǎng)葉細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)特征研究的最好方法。包裹冇CD45抗體的10珠法是分離用于產(chǎn)前診斷的滋養(yǎng)葉細(xì)胞最常用的方法，因其純度高，富集能力強(qiáng)（32倍）且收獲率高（78%）oWachter等［6］用電荷流式分類

6、（CFS）法對(duì)T6例孕婦（懷男嬰13例、Downs氏綜合征2例、18三休死嬰1例）外周血樣進(jìn)行初步分離，發(fā)現(xiàn)每20ml血樣屮平均冇2000個(gè)胎兒NRBC,均經(jīng)與染色體的熒光原位朵交（FISH）證實(shí)。Bianchi等［7］應(yīng)用針對(duì)胎兒紅細(xì)胞抗原即運(yùn)鐵蛋白受體（CD71）、thromfospondin受體（CD36）和血型糖蛋白A（GPA）的三種不同的單克隆抗體方法作為熒光激活細(xì)胞流式分類。結(jié)果表明用抗CD71或CD36鑒別出胎兒性別的和確度分別為57%和88%,而用抗GPA分離的細(xì)胞預(yù)報(bào)胎兒性別的正確率為100%oSteel等［2

7、］開發(fā)了一種快速、價(jià)廉的簡易技術(shù)從孕婦周用血屮富集紅細(xì)胞，其原理是在初步消除孕婦血中的單核細(xì)胞后接著進(jìn)行陽性選擇。其程序?yàn)槭占缙诨蝈谠袐D周圍血，通過Ficollhypaque密度梯度離心分離得單核細(xì)胞（包括有胎兒有核紅細(xì)胞）混懸液，然后用抗CD45/抗CD14的混合劑（與孕婦血中的大部分單核細(xì)胞起免疫反應(yīng)）處理，接看加入粘附于含鐵膠粒的山羊抗鼠IgG,并形成含鐵的非有核紅細(xì)胞及單核細(xì)胞，在磁場(chǎng)的作用下這些細(xì)胞被吸引住并將其棄除，余下有核紅細(xì)胞。最示一步是有核紅細(xì)胞的陽性選擇。首先加入CD71抗體，然后象上述一樣加含鐵溶液，再

8、次混合并放置于磁場(chǎng)中，此吋，粘附于磁極大多是有核紅細(xì)胞，洗凈后將其從磁極中移開即可進(jìn)行FISH分析。Simpson等［8］在研究持續(xù)流式方法及其敏感性、特異性時(shí)發(fā)現(xiàn)，五種血型糖蛋白A的抗體均產(chǎn)牛?凝集作用，故不將具作為胎兒細(xì)胞的陽性選擇標(biāo)記，而以CD71+細(xì)胞或