酵母細(xì)胞表面展示

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1、酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)及其在高通量篩選中的應(yīng)用目錄酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)的概述酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)在高通量篩選中的應(yīng)用酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)概念酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)基本原理酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)常見系統(tǒng)酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)的概述酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)的特點(diǎn)酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)的概述酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)(SurfaceDisplay)是一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。它是一類篩選蛋白質(zhì)突變體庫(kù)的高通量篩選方法，在抗體蛋白的研究中應(yīng)用尤其廣泛，具有高效、靈敏等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景?；驹恚菏菍⑼庠窗械鞍谆蚺c特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，用酵母細(xì)胞

2、內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將目的蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面并且固定在細(xì)胞膜上。與其它表面展示系統(tǒng)相比,酵母表面展示系統(tǒng)可克服真核蛋白在原核細(xì)胞表達(dá)時(shí)活性降低或失活的缺點(diǎn)。最常見的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括:凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)是將外源基因與酵母編碼α-凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號(hào)序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號(hào)肽下游,融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后,信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌,由于融合蛋白C-末端存在含GPI錨定信號(hào)的凝集素多肽序列,可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中,從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。凝集素展示表達(dá)凝集素系統(tǒng)又分為α-凝集素(Agα)系統(tǒng)和a-凝集素(Aga)系統(tǒng)在α-凝集

3、素系統(tǒng)中，α凝集素的C端可錨定在酵母細(xì)胞壁的葡聚糖上，外源蛋白作為N端與α凝集素C端融合，在信號(hào)肽引導(dǎo)下分泌表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了外源蛋白的展示表達(dá)。a-凝集素是Agalp和Aga2p亞單位通過二硫橋相連，其中Agalp通過β-葡聚糖共價(jià)連接在細(xì)胞壁上，目的蛋白與Aga2p的N端融合表達(dá)后，再通過Agalp與酵母細(xì)胞壁的共價(jià)連接而展示在細(xì)胞表面。絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合,并將融合蛋白展露表達(dá)在細(xì)胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子統(tǒng):GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素FLo1p的C-末端含有的GPI信號(hào)錨定外源蛋白,此系統(tǒng)與凝集素展示相似。

4、絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用FLo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識(shí)別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。絮凝素展示表達(dá)酵母表面展示技術(shù)的特點(diǎn)表達(dá)偏差小融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量范圍大篩選、純化、活性測(cè)定方便融合蛋白分子數(shù)量多特點(diǎn)酵母表面展示酵母表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用酒精發(fā)酵生物吸附高通量篩選為了簡(jiǎn)化纖維素乙醇生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)纖維素利用與乙醇發(fā)酵的同步進(jìn)行，莫春玲等通過酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)，以釀酒酵母菌株SaccharomycescerevisiaeY5為受體，通過絮凝素(Flo1p)錨定方式，將來自絲狀真菌里氏木霉Trichod

5、ermareesei的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纖維二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及來自棘孢曲霉Aspergillusaculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI)展示在細(xì)胞表面，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)3種纖維素酶的酵母菌群系統(tǒng)。經(jīng)過免疫熒光驗(yàn)證展示酶的細(xì)胞蛋白定位，酶活測(cè)定，乙醇發(fā)酵性能驗(yàn)證，結(jié)果表明：展示表達(dá)的3種纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和功能活性；乙醇發(fā)酵該系統(tǒng)已經(jīng)得到成功開發(fā)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多亟待解決的問題，例如：展示在細(xì)胞表面的纖維素酶的活性與游離酶相比有所下降；成功展示的纖維素酶穩(wěn)定性有待提高。即使如此，利用酵母表面展示技術(shù)表達(dá)纖維素酶的新型酵母菌群進(jìn)行纖維素乙醇

6、發(fā)酵效果還不是很理想，乙醇產(chǎn)率較低，難以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。在EGII、CBHII和BGLI協(xié)同作用下重組酵母菌株能夠水解溶脹磷酸纖維素(Phosphoricacidswollencellulose，簡(jiǎn)稱PASC)并產(chǎn)生乙醇，乙醇濃度達(dá)到最大值0.77g/L，乙醇產(chǎn)量為0.35g/L，相當(dāng)于理論值的68.6%。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)在高通量篩選中的應(yīng)用高通量篩選高通量篩選的概念1酵母細(xì)胞展示在HTS中的主要應(yīng)用3高通量篩選的技術(shù)過程2什么是high-throughputscreening高通量篩選（HTS）又稱大規(guī)模集群式篩選，是由高容量化合物庫(kù)、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測(cè)、高特

7、異篩選模型、高效率數(shù)據(jù)處理5個(gè)子系統(tǒng)有機(jī)組合而成，是一種新型的篩選技術(shù)。高通量篩選的技術(shù)過程1、樣品庫(kù)2、初篩和復(fù)篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導(dǎo)化合物6、確證篩選藥物藥理學(xué)研究7、侯選藥物8、臨床前研究藥物篩選定向進(jìn)化酵母展示在高通量篩選中的應(yīng)用藥物篩選把酵母應(yīng)用于藥物篩選，最早始于利用酵母雙雜交技術(shù)來確定藥物靶點(diǎn)。隨之發(fā)展起來的基于靶點(diǎn)的藥物篩選至今已有大量成功先例。選擇的靶點(diǎn)基本上可分為四種類型：離子通道、核受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)和酶。直接活性篩選可通過酵母系統(tǒng)直接進(jìn)行化合物活性篩選，