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1、學(xué)校代碼：學(xué)號(hào)：100232005010lO基于酵母表面展示系統(tǒng)的HIV抗體分離和表達(dá)邊專業(yè)年級(jí)：姓名：導(dǎo)師：完成日期：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2005級(jí)劉萱馬超(教授)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)解剖與組胚教研室2013年6月摘要人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)的防治問題是當(dāng)今全球臨床研究人員亟需解決的重要課題。由于HIV具有高度變異的特點(diǎn)，研究人員在尋找能夠?qū)IV病毒提供具有長(zhǎng)效廣譜作用的中和抗體的過程中一直面臨著極大的困難。本文將通過設(shè)計(jì)有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分離并表達(dá)可與HIV特異
2、性結(jié)合的抗體。為此，需要解決兩個(gè)重要問題，如何選擇靶抗原以及如何展示抗體文庫。針對(duì)第一個(gè)問題，研究人員通過分析當(dāng)前已經(jīng)找到的HIV廣譜中和抗體，發(fā)現(xiàn)這些抗體對(duì)應(yīng)的病毒抗原表位主要分布在HIV包膜糖蛋白gpl20／gp41上的一些保守位點(diǎn)。因此，本課題組研究人員提出了找到合適靶抗原的新方法，即根據(jù)病毒表面的保守表位來設(shè)計(jì)并合成抗原肽?；谇捌诘难芯拷Y(jié)論，本文提出將靶抗原的設(shè)計(jì)定位于HIV廣譜中和抗體10E8所對(duì)應(yīng)的表位，即gp41近膜區(qū)域(membrane．proximalexternalregion，MPER)上的一段保守位點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)此保守位點(diǎn)
3、進(jìn)行化學(xué)合成與修飾，得到與實(shí)際抗原功能相近的一段多肽，從而利用合成的肽段篩選抗體文庫。解決第二個(gè)問題，需要從眾多的表面展示技術(shù)中，挑選一種用來展示抗體文庫。本文選擇酵母表面展示系統(tǒng)進(jìn)行抗體文庫的展示。一方面，由于酵母細(xì)胞作為真核細(xì)胞，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)加工等方面具有優(yōu)勢(shì)，更適合對(duì)人類抗體片段的表達(dá)及展示。另一方面，在實(shí)驗(yàn)過程中，酵母細(xì)胞也易于培養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)胞篩選。同時(shí)，本文選取易于基因操作和表達(dá)的單鏈抗體(SingleChainFragmentVariable，scFv)文庫展示在酵母細(xì)胞表面。在酵母細(xì)胞表面展示了包含有109個(gè)單
4、鏈抗體的非免疫人類單鏈抗體文庫，其中存在產(chǎn)生廣譜中和抗體的基因。本文提出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括如下三個(gè)步驟：首先，對(duì)酵母表面展示的單鏈抗體文庫進(jìn)行兩輪免疫磁珠分選(MegneticActivatedCellSorting，MACS)及兩輪流式細(xì)胞分選(FluorescenceActivatedCellSorting，F(xiàn)ACS)過程；其次，從篩選出的抗體文庫中隨機(jī)挑選30株進(jìn)行基因測(cè)序，對(duì)得到的12株不同單克隆進(jìn)行鑒定，其中有4株為陽性結(jié)果克?。蛔詈?，將這4株陽性克隆進(jìn)行單鏈抗體的分泌、純化，并進(jìn)一步構(gòu)建載體，將其以全長(zhǎng)形式進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)再次驗(yàn)證，以全長(zhǎng)形式
5、表達(dá)的抗體仍能夠與抗原肽結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)從酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)展示的單鏈抗體文庫中，分離和表達(dá)出可與靶抗原特異性結(jié)合的抗體，并建立從酵母表面展示的單鏈抗體文庫中篩選針對(duì)靶抗原的抗體的技術(shù)平臺(tái)。本文提出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)于未來的疫苗研發(fā)具有重要的意義。通過該實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究人員可以不斷地設(shè)計(jì)與改造抗原肽，從而找到能夠從抗體文庫中篩選出廣譜HIV中和抗體的肽段，并將此肽段作為病毒疫苗的前身，指導(dǎo)后續(xù)的疫苗研發(fā)。關(guān)鍵詞：酵母展示，HIV，細(xì)胞分選，抗原抗體反應(yīng)Isolatingandexpressinghumanantib
6、odiesofH1V0nyeastnl■l‘SUrlaceOiSDlaysystemAbstractRecently，ithasbeenagreatchallengefortheclinicalresearcherstofindsolutionstopreventanddefeatHIV(HumanImmunodeficiencyVirus)．AsHIVhasthecharacterofhighvariation，manyobstacleshavetobetackledforfindingbroadlyneutralizingantibodies
7、(nAbs)．ThisworkfocusesondesigningefficientexperimentplatformandsolutiontoisolateandexpressthespecificantibodiestargetedatHIV．Duringourwork，twoissueshavetobesolved：howtopickthetargetantigenandhowtodisplaytheantibodylibrary?Forthefirstissue，previousresearchworkshaveshownthatmos
8、toftheviralantigenepitopescorrespondingtotheseantibodieswerelocatedi
