酵母表面展示技術(shù)簡(jiǎn)介

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1、淺談酵母表面展示技術(shù)姓名：毛惠民學(xué)號(hào)：20101029指導(dǎo)老師：楊梅摘要：酵母表達(dá)體系同時(shí)具有真核細(xì)胞翻譯后蛋白加工修飾的過(guò)程與原核表達(dá)體系的特點(diǎn)，因此，以酵母為基礎(chǔ)的表面展示體系在諸多展示系統(tǒng)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文主要對(duì)酵母細(xì)胞展示的理論基礎(chǔ)、展示體系類型及應(yīng)用研究的進(jìn)展等進(jìn)行了初步探討。關(guān)鍵字：酵母、表面展示、凝聚素、GPIScott和Smith在1985年通過(guò)發(fā)現(xiàn)短肽鏈可以融合到絲狀噬菌體的錨定蛋白上，卻不影響其感染大腸桿菌的能力，最早提出表面展示技術(shù)，促進(jìn)了噬菌體表面展示系統(tǒng)的發(fā)展[1]。自從絲狀噬菌體表面展示技術(shù)創(chuàng)立以來(lái)，表面展示技術(shù)在很短的一段時(shí)間內(nèi)

2、得到快速發(fā)展，不同的實(shí)驗(yàn)室又分別發(fā)展T4噬菌體、T7噬菌體、細(xì)菌、桿狀病毒、酵母等表面展示系統(tǒng)。微生物細(xì)胞表面展示是通過(guò)將靶蛋白基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞，靶蛋白在載體蛋白的引導(dǎo)下表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面，保持相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和原有的生物學(xué)活性。微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)包括細(xì)菌展示系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)以及酵母展示系統(tǒng)。最早研究且比較成熟的系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)，它是將外源的多肽與絲狀噬菌體的次要外殼蛋白融合并展示在外殼表面，噬菌體展示系統(tǒng)目前主要用于從復(fù)雜的文庫(kù)中分離特異性的配體、抗原、抗體，由于噬菌體顆粒較小，展示蛋白的大小和數(shù)

3、量均有限。原核蛋白主要用細(xì)菌展示系統(tǒng)展示，革蘭氏陰性菌外表面有外膜，外源蛋白與暴露在細(xì)胞表面的外膜蛋白、脂蛋白、菌毛蛋白或鞭毛蛋白的末端融合后得到展示[2]。酵母展示系統(tǒng)是比較理想的、應(yīng)用最廣泛的展示系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)在于：遺傳操作方便；能對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行折疊、糖基化等翻譯后修飾，因而適宜表達(dá)真核蛋白；另外，酵母可以在廉價(jià)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到很高的細(xì)胞密度。1酵母表面展示系統(tǒng)原理細(xì)胞表面是細(xì)胞內(nèi)外的功能界面。一些表面蛋白橫穿過(guò)質(zhì)膜，另一些以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合一起。細(xì)胞能夠錨定特定的表面蛋白，并且能將其限制在細(xì)胞表面的特定區(qū)域。在生物技術(shù)中，細(xì)胞表

4、面通常用于研究蛋白跨膜的機(jī)理。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景[3]。2酵母表面展示系統(tǒng)基本組成2.1宿主細(xì)胞釀酒酵母一直被認(rèn)為是安全的模式生物（GRAS）而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，也是目前常見(jiàn)的用于酵母表面展示的宿主細(xì)胞。除釀酒酵母外，近年來(lái)酵母展示平臺(tái)已被拓展至某些能利用甲醇作為單一碳源和能量來(lái)源的細(xì)胞株，如巴斯德畢赤酵母

5、、漢遜酵母。與釀酒酵母相比，嗜甲醇酵母細(xì)胞株具有更優(yōu)越的發(fā)酵特性，如能夠在廉價(jià)的碳源中生長(zhǎng)和更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度，這些特性使其在需要大規(guī)模發(fā)酵的應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)，例如展示異源酶作為全細(xì)胞催化劑[4]。另外，畢赤酵母對(duì)外源蛋白的O-糖基化程度更高，因而對(duì)展示的外源酶具有更好的穩(wěn)定效果。2.2載體蛋白酵母細(xì)胞表面包被著一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，由內(nèi)層的葡聚糖骨架和外層的甘露糖蛋白構(gòu)成。甘露糖蛋白主要包括兩類蛋白質(zhì)：一種以非共價(jià)方式松散地結(jié)合于細(xì)胞壁，可以用SDS抽提；另一類蛋白必需以β-1,3或β-1,6葡聚糖酶消化細(xì)胞壁后才能抽提，這類蛋白常含有GPI錨定區(qū)域。α-凝集素和

6、絮凝素以及細(xì)胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p等都屬于GPI家族蛋白，外源蛋白與它們?nèi)诤虾罂杀还矁r(jià)錨定于細(xì)胞表面，這些蛋白是常用的酵母表面展示載體蛋白。2.3外源蛋白酵母表面展示系統(tǒng)適合展示各種真核蛋白，包括酶、細(xì)胞識(shí)別因子、受體、抗體、抗原等，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、全細(xì)胞催化、生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞吸附、分子識(shí)別、生物治療、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物傳感器和疫苗等領(lǐng)域。外源蛋白與載體蛋白的融合方式有C末端融合、N末端融合、插入融合。對(duì)某些外源蛋白，選擇恰當(dāng)?shù)娜诤戏绞娇梢悦黠@改善展示效果或蛋白的功能特性，如Aga2p蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以N末端或C末端兩種

7、方式與其融合。研究表明抗CD3ε單鏈抗體融合于Aga2p蛋白C末端時(shí)，其親和力較天然蛋白降低30～100倍[5]，而融合于N末端時(shí)活性得以恢復(fù)。3酵母表面展示系統(tǒng)的類型目前，最常見(jiàn)的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括:凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)[6]。凝集素展示表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號(hào)序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號(hào)肽下游，融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌，由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號(hào)的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中，從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因

8、與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達(dá)在