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1、植物抗旱生理指標(biāo)測定原理及方法生命科學(xué)學(xué)院楊歌指標(biāo)測定:一、可溶性糖(蒽酮法)二、脯氨酸三、丙二醛四、葉綠素五、蛋白(考馬斯亮藍(lán)法)六、超氧化物歧化酶(SOD)七、過氧化物酶(POD)八、谷胱甘肽(GSH)九、電導(dǎo)率一、可溶性糖含量的測定1.蒽酮法1.1原理糖在濃硫酸作用下,可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛,生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物,在可見光吸收峰位620nm。測定對(duì)象:幾乎可以測定所有的碳水化合物,而且可以測所有寡糖類和多糖類,其中包括淀粉、纖維素等(反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng),所以
2、用蒽酮法測出的碳水化合物含量,實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量)。1.2步驟試劑:(1)濃硫酸;(2)蒽酮乙酸乙酯試劑:蒽酮------------1g加乙酸乙酯至----50ml實(shí)驗(yàn)步驟:(1)稱取樣品0.1g,置于研缽中,加4mlddH2O研磨成勻漿,8mlddH2O洗滌研缽。(2)100°C沸水浴10min,冰上冷卻。(3)4000rpm離心10min。(4)取上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容。(5)1ml提取液+1mlddH2O+0.5ml蒽酮+5ml濃硫酸,輕輕混合均勻,100°C沸水浴10min,冰上冷卻。(6)
3、620nm處測吸光值。1.3計(jì)算方法可溶性糖含量%?=?C*V/(W*10^6)*100%?V為植物樣品稀釋后的體積(ml)------100mlC為提取液的含糖量(μg/ml)--------根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算W為植物組織鮮重量(g)-------------0.1g問題及質(zhì)疑:1.目標(biāo)糖含量:標(biāo)準(zhǔn)曲線是用葡萄糖位標(biāo)準(zhǔn)制作的,而蒽酮法是測總糖的量,包括己糖、戊糖,濃硫酸將淀粉、纖維素水解成的單糖,將總糖得出的OD值代入由單一糖做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,有一定誤差存在。注:查看所有文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是用葡萄糖制作。2.誤差分析:(1)不同糖類與蒽
4、酮試劑反應(yīng)的顯色程度不同。果糖最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖較淺,五碳糖最淺造成誤差。(2)蒽酮試劑溶解度較低,非常容易析出,在反應(yīng)時(shí)加入糖的水溶液中,出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,影響反應(yīng)進(jìn)行。(3)介于以上原因,將上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容,稀釋程度過大,當(dāng)糖含量少的時(shí)候,大的誤差可能會(huì)掩蓋真實(shí)的糖含量。造成品數(shù)據(jù)沒有實(shí)際意義。方案修改意見:1.首先,做五到六組空白,測試分光光度計(jì)誤差程度。2.增加平行組數(shù),由三組增加至五組,減少每個(gè)樣品測試次數(shù)。3.改變測試樣品定容量,由100ml變?yōu)?0ml。脯氨酸含量的測定1.茚三酮法1.1原理
5、在正常環(huán)境條件下,植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低,但在逆境(干旱、低溫、高溫、鹽漬等)及植物衰老時(shí),植物體內(nèi)游離脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性有關(guān)。用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí),脯氨酸游離于磺基水楊酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加熱處理后,溶液即成紅色,再用甲苯處理,則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中,色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或用回歸方程計(jì)算)脯氨酸的含量。1.2步驟試劑:(1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g冰乙酸---------
6、---15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶;(2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀釋至原體積的2.3倍;(3)3%磺基水楊酸:磺基水楊酸------3g加蒸餾水至------100ml實(shí)驗(yàn)步驟:(1)稱取0.1g樣品放入研缽,加5ml3%磺基水楊酸研磨成勻漿,100°C沸水浴15min;(2)冰上冷卻,4000rpm離心10min;(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均勻,100°C沸水浴30min,冰上冷卻;(4)加4ml甲苯混合均勻,震蕩30s,靜置30min;(5)以甲苯為空白對(duì)照,
7、再520nm下測定吸光值。1.3計(jì)算方法脯氨酸含量(μg/gFW)=X*提取液總量(ml)/樣品鮮重(g)*測定時(shí)提取液用量(ml)*10^6公式中:X-----從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量(μg)提取液總量---------------------------5ml測定時(shí)提取液用量---------------------2ml問題及質(zhì)疑:1.酸性體系下,脯氨酸與茚三酮加熱反應(yīng)后的最終產(chǎn)物為紅色,再實(shí)驗(yàn)過程中,僅有少數(shù)時(shí)候能發(fā)現(xiàn)紅色產(chǎn)物。原因有待確定。2.經(jīng)查看文獻(xiàn)資料,反應(yīng)步驟已經(jīng)是優(yōu)化的,沒有問題。甲苯萃取脯氨酸與茚三酮的反應(yīng)
8、產(chǎn)物,消除了多余未反應(yīng)的茚三酮,磺基水楊酸,提取液中其他雜質(zhì)(如色素)以及PH變化的干擾。3.根據(jù)茚三酮與脯氨酸的縮合反應(yīng)分析:(1)反應(yīng)體系的PH控制很重要,保持酸性環(huán)境,否則,反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸光值并不在520nm。(