植物抗旱生理指標(biāo)測定原理及方法

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1、植物抗旱生理指標(biāo)測定原理及方法生命科學(xué)學(xué)院楊歌指標(biāo)測定：一、可溶性糖（蒽酮法）二、脯氨酸三、丙二醛四、葉綠素五、蛋白（考馬斯亮藍(lán)法）六、超氧化物歧化酶（SOD）七、過氧化物酶（POD）八、谷胱甘肽（GSH）九、電導(dǎo)率一、可溶性糖含量的測定1.蒽酮法1.1原理糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在可見光吸收峰位620nm。測定對象：幾乎可以測定所有的碳水化合物，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等（反應(yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全

2、部可溶性碳水化合物總量）。1.2步驟試劑：(1)濃硫酸；(2)蒽酮乙酸乙酯試劑：蒽酮------------1g加乙酸乙酯至----50ml實驗步驟：（1）稱取樣品0.1g，置于研缽中，加4mlddH2O研磨成勻漿，8mlddH2O洗滌研缽。（2）100°C沸水浴10min，冰上冷卻。（3）4000rpm離心10min。（4）取上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容。（5）1ml提取液+1mlddH2O+0.5ml蒽酮+5ml濃硫酸，輕輕混合均勻，100°C沸水浴10min，冰上冷卻。（6）620nm處測吸光值。1.3計算方法可溶性糖含量%?=?C*V/(W*10^6)*100%?

3、V為植物樣品稀釋后的體積（ml）------100mlC為提取液的含糖量（μg/ml）--------根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算W為植物組織鮮重量（g）-------------0.1g問題及質(zhì)疑：1.目標(biāo)糖含量：標(biāo)準(zhǔn)曲線是用葡萄糖位標(biāo)準(zhǔn)制作的，而蒽酮法是測總糖的量，包括己糖、戊糖，濃硫酸將淀粉、纖維素水解成的單糖，將總糖得出的OD值代入由單一糖做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，有一定誤差存在。注：查看所有文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線都是用葡萄糖制作。2.誤差分析：（1）不同糖類與蒽酮試劑反應(yīng)的顯色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖最淺造成誤差。（2）蒽酮試劑溶解度較低，非常容易析出，在反應(yīng)時加

4、入糖的水溶液中，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，影響反應(yīng)進(jìn)行。（3）介于以上原因，將上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶定容，稀釋程度過大，當(dāng)糖含量少的時候，大的誤差可能會掩蓋真實的糖含量。造成品數(shù)據(jù)沒有實際意義。方案修改意見：1.首先，做五到六組空白，測試分光光度計誤差程度。2.增加平行組數(shù)，由三組增加至五組，減少每個樣品測試次數(shù)。3.改變測試樣品定容量，由100ml變?yōu)?0ml。脯氨酸含量的測定1.茚三酮法1.1原理在正常環(huán)境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量較低，但在逆境（干旱、低溫、高溫、鹽漬等）及植物衰老時，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游離脯氨酸積累量與逆境程度、植物的抗逆性

5、有關(guān)。用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計算）脯氨酸的含量。1.2步驟試劑：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶；（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀釋至原體積的2.3倍；（3）3%磺基水楊酸：磺基水楊酸------3g加蒸餾水至------100ml實驗步驟：（1）稱取

6、0.1g樣品放入研缽，加5ml3%磺基水楊酸研磨成勻漿，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷卻，4000rpm離心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均勻，100°C沸水浴30min，冰上冷卻；（4）加4ml甲苯混合均勻，震蕩30s，靜置30min；（5）以甲苯為空白對照，再520nm下測定吸光值。1.3計算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝X*提取液總量（ml）/樣品鮮重（g）*測定時提取液用量（ml）*10^6公式中：X-----從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（μg）提取液總量---------------------------5ml測定時提

7、取液用量---------------------2ml問題及質(zhì)疑：1.酸性體系下，脯氨酸與茚三酮加熱反應(yīng)后的最終產(chǎn)物為紅色，再實驗過程中，僅有少數(shù)時候能發(fā)現(xiàn)紅色產(chǎn)物。原因有待確定。2.經(jīng)查看文獻(xiàn)資料，反應(yīng)步驟已經(jīng)是優(yōu)化的，沒有問題。甲苯萃取脯氨酸與茚三酮的反應(yīng)產(chǎn)物，消除了多余未反應(yīng)的茚三酮，磺基水楊酸，提取液中其他雜質(zhì)（如色素）以及PH變化的干擾。3.根據(jù)茚三酮與脯氨酸的縮合反應(yīng)分析：（1）反應(yīng)體系的PH控制很重要，保持酸性環(huán)境，否則，反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸光值并不在520nm。（