激光共聚焦顯微鏡技術(shù)1

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1、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)ThetechniquesandapplicationsofConfocalLaserScanningMicroscopy激光共聚焦顯微鏡(LSCM)的發(fā)展簡史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美國的專利。1978年，阿姆斯特丹大學(xué)的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦顯微鏡。1985年，WijnaendtsvanResandt推出了第一臺對熒光標(biāo)記的材料進(jìn)行光切的共焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡(LSCM)的發(fā)展簡史

2、o80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦顯微鏡,英國的Bio-Rad公司的MRC系列，德國Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。o近二十年來，從濾片型到光譜型，人們對共焦高分辨率，采集圖像快速，技術(shù)的改進(jìn)及應(yīng)用開發(fā)不斷進(jìn)行，出現(xiàn)了很多新的技術(shù)。如雙光子，F(xiàn)CS,FLIM,STED等。共焦顯微鏡的優(yōu)點人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25μm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mμm共焦顯微鏡的優(yōu)點o電子顯微鏡的缺陷：1.只能觀察固定樣品2.樣品制備

3、過程（固定、包埋、切片）造成的假象o熒光顯微鏡的缺陷:1.可以觀察活細(xì)胞或組織，但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊。2.熒光具有強散射性，造成圖像實際清晰度的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.如果熒光濾片選配不當(dāng)，多熒光標(biāo)記樣品圖像的采集很困難，且很難抑制光譜交叉。共焦顯微鏡的優(yōu)點o共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)o共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)o共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微

4、鏡的區(qū)別3.增加側(cè)向分辨率激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)FluorescentMicroscopevsconfocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)掃描方式激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)原理小結(jié):Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔內(nèi)，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即為共焦點，被探測點所

5、在的平面即為共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:1.點照明。2.具有照明pinhole和探測pinhole。3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測

6、點所在的平面為共焦平面。4.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像。5.具有多個（五個）熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物。6.使用AOTF(Acousto-OpticalTunableFilter)進(jìn)行激光波長和強度的選擇，并以極超快速控制激光開和關(guān)，從而實現(xiàn)任意形狀感興趣區(qū)域掃描的功能,實現(xiàn)了實時快速檢測。7.AOBS(Acousto-OpticalBeamSplitter)：更好的減少了激發(fā)光對發(fā)射熒光的干擾。8.光譜檢測器：任意選擇接受光譜的波長和帶寬。AOBS(Acousto-OpticalBeam

7、Splitter)AOBS的作用p特定波長的激發(fā)光經(jīng)過AOBS后發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入光路p樣品產(chǎn)生的熒光直接通過AOBS到達(dá)檢測器，而反射回來的激發(fā)光經(jīng)過AOBS后發(fā)生偏轉(zhuǎn)不能到達(dá)檢測器。p優(yōu)點：與傳統(tǒng)的二色光分光鏡相比，增大了熒光的接受率。p更好的阻止了激發(fā)光對發(fā)射熒光的干擾。光譜檢測器棱鏡分光，光譜檢測激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)o分辨率1.光學(xué)分辨率只與物鏡的數(shù)值孔徑NA和檢測波長有關(guān)xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61l/NA（0.25mm)Confocal:Rxy=0.4l/N

8、A（0.18mm)2.采樣分辨率固定物鏡倍率下，Zoom相同時，無論采樣密度大小，采樣面積是固定的。理論上，固定面積下，采樣密度越高，即采樣點越多，圖像越細(xì)膩。但是，采樣密度越高，掃描一幅圖像的速度越慢，熒光強度越低，樣品也越容易被淬滅。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)o圖像亮度1.與物鏡NA有關(guān)。物鏡鏡像亮度與數(shù)值孔徑的平方呈正比，與總放大率的平方呈反比。L=NA2/M2,NA大小相同，倍率越高，鏡像亮度越低2.與pinhole大小有關(guān)。M2=(M1×M2)2Pinhole大小的選擇理論上